Nuevos productos de origen natural y sintético con actividad antitumoral

              Rev. Acad. Canar. Cienc., XVII (Núm. 3), 85-141 (2005) (publicado en agosto de 2006)
NUEVOS PRODUCTOS DE ORIGEN NATURAL Y SINTÉTICO
CON ACTIVIDAD ANTITUMORAL
Discurso leído por el Académico Electú
Iltmo. S1·. D. ÁNGEL GUTIÉRREZ RAVELO
en el acto de su recepción el día 16 de diciembre de 2005
Discurso de contestación
por el Académico Numerario
Excmo. Sr. D. ÁNGEL GUTIÉRREZ NAVARRO
Rector Magfco. de la Unive rsidad de La Laguna
Excmo. Sr. Presidente
Excmo. Sres. Académicos
Señoras y Señores
En primer lugar quiero agradecer a los miembros de la Academia Canaria de Ciencias el
honor que me han dispensado nombrándome miembro de la misma.
Deseo expresar mi gratitud a mis profesores. de D. Nacere Hayek y D. José Bretón, Y más
tarde compañeros en la Universidad de La Laguna, por presentar mi candidatura.
Intentaré con mi trabajo en esta prestigiosa institución hacerme valedor de este nombramiento.
Extiendo mi reconocimiento al Prof. Angel M. Gutiérrez Navarro, por sus iniciativas en la
Academia Canaria de Ciencias y por llevar a cabo mi presentación en este Acto. Además de coincidir
en nombre, apellido y profesión hemos compartido muchos años en la ULL y una amistad franca,
directa y leal.
Respetuosamente me dirijo a mi profesor el también Académico D. Agustín Arevalo que
continúa siendo un ejemplo de dedicación y magisterio.
Mi gratitud para los profesores y compañeros el Académico Dr. Francisco García
Montelongo, con el que me inicie en las labores de investigación, en aquellos momentos compartí
espacios con D. Jorge Fuentes Duchemín, cuya amistad valoré y valoro sobremanera. No quiero
olvidar a D. B. Manuel Fraga, compañero de carrera y codirector de tesis.
Gracias a todos aquellos alumnos y compañeros, de los que tanto he aprendido, los que me
acompañan en mi actual grupo de trabajo; los Ores. Ana Estévez, Rafael Zarate, José Juan Marrero,
Elisa Pérez y los licenciados Dulce Mesa, Nabil el Jaber, Sandra Jiménez, Juan Carlos Cedrón,
Fátima Gutiérrez, Gabriela Borges, Elena Cequier, Daniel García, la administrativa María de Juan y
el técnico Gregario Roig.
Mención especial al Prof. A. González que con su inteligencia, dedicación, indesmayable
entusiasmo, ilusión y optimismo frente a los problemas ha sido una de las personas en la que he
querido mirarme como ejemplo inalcanzable.
La ULL, el Instituto de Bio-Orgánica y el Departamento de Química Orgánica me han
generado un agradable ambiente de trabajo y me he sentido afortunado de tener excelentes
compañeros, técnicos y administrativos. Sin estos factores hubiera sido imposible llevar a cabo mi
investigación, mi puerta al día. Sólo me basta mirar cómo, dónde y con que empecé y ver la
situación en la que me encuentro en este momento.
No quiero terminar esta parte de mi intervención sin nombrar a mi familia por su ayuda y
apoyo constante; a mis padres, a Ninona, mi mujer y a mis cuatro hijos Tomás, Cristina, Adrián y
Ana, indispensables en esta aventura de la vida.
A continuación paso a presentar un resumen de mi trabajo que he denominado:
87
NUEVOS PRODUCTOS DE ORIGEN NATURAL Y SINTÉTICO CON
ACTIVIDAD ANTITUMORAL
Uno de los objetivos principales de nuestro trabajo durante más de veinte años ha sido el
de obtener sustancias con actividad antitumoral a partir de productos naturales y sintéticos.
Las cinco líneas principales de trabajo:
A) Nuevas sustancias antitumorales de origen natural y obtención de quimiotecas
focal izadas
B) Productos útiles para la quimioprevención del cáncer inducido por infecciones
virales
C) Búsqueda de revertidores de la multiresistencia a fármacos anticancerígenos
D) Biotecnología e Ingenieda Genética de Rutas Metabólicas
E) Química Macro y supramolecular
Los resultados obtenidos hasta ahora nos indican que nos encontramos con nuevas
sustancias potencialmente útiles en la lucha contra el cáncer y con la posibilidad de
convertirse en fármacos de uso clínico.
Se han generado publicaciones, patentes, contratos y proyectos con la industria (empresas
FAES, SYTEN, BIOMAR), basados en nuestra actividad investigadora.
11. Introducción
Los sistemas de medicina tradicional basados en plantas han sido utilizados por todo
el mundo durante cientos de años y en la actualidad siguen jugando un importante papel en
los cuidados de la salud'-4. La Organización Mundial de la Salud (WHO) estima que
aproximadamente el 80% ~e los habitantes del mundo recurren a la medicina tradicional
para Jos cuidados de atención primaria5
•
6
• El uso de productos naturales en el diseño de
fármacos representa de una forma aproximada la evolución natural de esta antigua
tradición.
Uno de los problemas sanitarios más importantes que se plantean en Ja actualidad es
1 tratamiento de las enfe~edades tumorales7
• Junto con la prevención y su vertiente de la
e uimioprotección, las técnicas quirúrgicas, las técnicas que usan energías radiantes en sus
d·versas versiones y todo ~I ~agaje científico que se está acumulando tras el descubrimiento
d
1
Jos oncogenes, la qmm1oterapia, es decir el uso de agentes químicos de estructura
e nocida, constituye una herramienta muy utilizada. A su vez, el uso de esas sustancias, da
~~gar a la aparición ~e la multiresistencia (MOR), que puede ser eliminada con Jos
corres pondientes revert.1 d.o res. , . Los agentes qmm1oterapeut1cos que se usan actua 1m ente poseen un amplio espectro
tructuras químicas, hasta el punto de que no puede hablarse de una relación definida
de es estructura y actividad y ni siquiera entre tipo de estructura y actividad. Por otro lado,
entre canismos, a través de los cuales estos agentes detienen el crecimiento selectivo de las
Jos me
88
f
células cancerígenas frente a las células normales, se reducen a unos pocos. Con no mucha
frecuencia aparecen fármacos con un mecanismo de acción desconocido que se encuentra
en fase de investigación o bien se ha descubierto un nuevo mecanismo de acción. Así, por
ejemplo, el taxol o placlitaxe18 de Rhone-Poulanc ejerce su acción inhibiendo la mitosis al
interaccionar con los microtúbulos e induciendo haces estables de éstos. El alcaloide natural
colchicina y el lignano podofillotoxina inhiben también la mitosis impidiendo la
polimerización de la tubulina, de manera parecida a como lo hacen los alcaloides de la
Vinca, vincristina y vinblastina. El cisplatino9
, otro antineoplásico profusamente utilizado,
interacciona directamente con el DNA, formando un quelato del platino con dos átomos de
nitrógeno (N-7) de guanina, impidiéndose así la replicación del DNA. El metotrexato
ejerce su acción inhibiendo a la dehidrofolato reductasa, una enzima clave en la biosíntesis
de las bases nitrogenadas del DNA, a la que se une con una KD = 10-11 M. La velocidad de
disociación del complejo enzima-inhibidor in vivo es lo suficientemente baja para privar a
la célula de los intermediarios en la síntesis del DNA durante un período en el que se
induce la muerte celular. La estructura del complejo enzima-inhibidor está bien
determinada por rayos X, observándose como a pH fisiológico la porción 2,4-
diaminopteridina del metotrexato está protonada y se une a restos carboxilato del centro
activo. La inhibición de las topoisomerasas por ciertos tipos de lignanos es otro ejemplo de
acción anticancerígena a nivel de una actividad enzimática clave. También ha sido decisivo
el descubrimiento de los cánceres dependiente de hormonas.
Como resultado de los recientes avances en biología, existe ahora una demanda
creciente de nuevos productos naturales. Específicamente, los campos de la genómica y
proteómica prometen la rápida identificación de un gran número de productos genéticos
para los cuales pequeñas moléculas moduladoras serán tanto de interés biológico como
médico10
"
14
• Además la combinación de biología celular y alta tecnología ha llevado al
desarrollo de varios ensayos celulares en los cuales pequeñas librerías de moléculas pueden
ser utilizadas para identificar y estudiar dianas previamente desconocidas15
"
16
• En los
últimos años ha adquirido una gran relevancia el concepto de estructuras privilegiadas,
término usado por primera vez por Evans y colaboradores17
"
18 para describir tipos de
esqueletos seleccionados que se unen a múltiples y no relacionadas clases de receptores
proteicos como ligandos con una alta afinidad. Recientemente Waldman y colaboradores
han desarrollado el concepto de dominio para una más eficiente investigación en la
búsqueda de fármacos candidatos. Esta estrategia esta basada en dominios de proteínas
móviles conservadas estructural y genéticamente y los correspondientes productos naturales
seleccionados durante la evolución. Los productos naturales biológicamente activos pueden
considerarse entidades químicas que fueron seleccionados evolutivamente y validadas por
su anclaje a particulares dominios de proteínas. Las estructuras que subyacen en estos tipos
de productos naturales deben de proveernos de una potente guía para el desarrollo de
nuevas moléculas bioactivas 19
"
2º.
Teniendo todas estas ideas en mente en el presente trabajo motramos nuevas
estruc:turas privilegiadas y desarrollado pequeñas quimiotecas de análogos de productos
naturales bioactivos como revertidores del fenotipo MDR de fármacos anticancerígenos,
como antit111norales y quimiopreventivos.
111. Antecedentes y Resultados obtenidos
Como resultado de nuestros trabajos de investigación en metabolitos secundarios
bioactivos de origen natural y derivados sintéticos nuestras aportaciones en el campo de los
antitumorales se han desarrollado fundamentalmente en tomo a cuatro familias de
productos naturales y una sintética de novo:
89
a) Triterpenoquinonas y triterpenofenoles
b) Sesquiterpenos P-dihidroagarofuranos
c) Naftoquinonas isoprenílicas
d) Benzotropolonas
e) Bispiranoquinona
A continuación pasaremos a comentar las aportaciones y logros más significativos
conseguidos con dichas moléculas en la evaluación de su potencial antitumoral,
quimiopreventivo del cáncer y como revertidotes del fenotipo de MOR.
A) Actividad Antitumoral
El cáncer será la primera causa de muerte en el siglo XXI, y los productos naturales
deben proveer nuevos agentes anti-cáncer más efectivos.
Hemos trabajado en el aislamiento, elucidación estructural y modificación por vía
química de las estructuras de productos naturales que han sido activos como antitumorales
en alguno de los siguientes mecanismos: daño a células tumorales en cultivo, daños al
ADN, inducción de apoptosis e inhibidores de la enzima colino-quinasa.
Los productos estudiados como resultado de nuestros trabajos de investigación se
refieren a cuatro familias químicas: triterpenoquinonas, sesquiterpenos P-dihidro
agarofuranos, naftoquinonas isoprenílicas y benzotropolonas. Junto a familia sintética de
bispiranoquinona.
En trabajos previos, las quinonas triterpénicas habían mostrado interesantes
actividades citotóxicas frente a líneas celulares tumorales21 . Las líneas celulares utilizadas
en nuestros estudios han sido básicamente: P-388: linfoma de ratón (A TCC:CCL46); A-
549: carcinoma de pulmón humano (A TCC:CL85); HT-28: carcinoma humano de colon
(ATCC:HTB38); MEL-28: melanoma humano (ATCC:HTB72). Al objeto de mejorar
estos resultados, llevamos a cabo modificaciones químicas orientadas a obtener derivados
más activos y/o selectivos, así como para establecer relaciones estructura-actividad.
Las prenil-naftoquinonas constitu1en un grupo importante de productos naturales
estudiados en la investigación del cánce~2 . Algunas quinonas relacionadas con el lapacho)
poseen un potencial notable como quimiopreventivos del cáncer, como se verá más
adelante en el correspondiente apartado.
Los sesquiterpenos (3-dihidroagarofuránicos han mostrado actividad antitumoral en
cultivos celulares23, pero las estructuras por nosotros estudiadas han mostrado baja
actividad hasta el momento24. Los datos de la bibliografia hablan de productos bioactivos
con estereoquímicas y sustituyentes distintos a los que poseen nuestros compuestos. Sin
embargo los que hemos aislados han destacado por su potencial como revertidores de la
resistencia a fármacos antitumorales.
Las tropolonas y benzotropolonas de origen natural son escasas y, en general, muy
activas. Hemos aislado, y determinado la estructura de una tropolona y un aducto Diels­Alder
de una tropolona que poseen actividad genotóxica con potencial como fármaco anti­cáncer25.
Las· bispiranoquinona son una nueva familia de revertidores de la
multiresistencia a drogas anticancerígenas.
A-a) Nor-metilenquinonas triterpénicas con actividad antitumoral.
En un trabajo reciente sobre revisión de productos naturales con actividad
anticancerígena26, dimos cuenta de nuestro trabajo de los últimos veinte años con productos
90
bioactivos de estas familias y presentamos también los resultados de las modificaciones
sintéticas que nos han llevado a las series más potentes hasta ahora conocida.
El esqueleto básico de estos compuestos se presenta en la Figura 1, e
invariablemente contiene funciones oxigenadas en los carbonos C-2 y C-3. con una única
excepción, el celastranhídrido27
, cuyo anillo A ha sufrido una Figura t 30 29
ruptura oxidativa. Otros lugares de oxidación del sistema _,. .'. '
metilenquinónico son los carbonos C-6 y C-7. Aquellos
triterpenos con una insaturación adicional en C-14( 15), presentan
una migración de metilo y fueron aislados y caracterizados por
primera vez en nuestro laboratorio28
• El sistema más común de 2
oxidación fuera de los anillos A y B es el carbono C-29, en
forma de alcohol, ácido o metiléster. También se han encontrado
productos que han perdido el grupo ácido en C-29, dando los 23
22
28
correspondientes nor-derivados. Otras posiciones oxidadas son C-15, C-21, C-22, C-23 y
C-28. Los grupos más importantes de esta familia de compuestos se muestran en la Figura
2, en la línea inferior se muestran ejemplos de nor-catecoles.
Figura 2
o
HO
Quinonemethides 7-0xoquinonemethides 14(15)-Enequinonemethides
Phenolic 6-0xopheno!ic
Hemos llevado a cabo estudios fitoquímicos de diversas especies, la mayoría del
género Maytenus (M horrida. M amazonica. M macrocarpa. M magellanica, M disticha.
M chubutensis. M boaria, M blepharodes, M cuzcoina, M canariensis, ... ). Aparte de la
actividad antitumoral, algunos miembros de esta familia poseen actividad antimicrobiana.
Las quinonas 1-8 (Figura 3), son los principales metabolitos secundarios presentes en las
raíces de las especies del género Maytenus, siendo su abundancia dependiente de la especie.
91
o
HO
Figura 3
o
(1) R1=H; R2==0; R3=0H
(2) R1=COOMe; R2=R3=H HO
(3) R1=COOMe; R2=0Hf3;R3=H
(4) R1=R3=H; R2==0
(5) R1=R3=H; R2=R.i=O
(6) R1=R3=H; R2==0; R4=0H
(7) R1=H; R2=R4==0; R3=0H
(8) R1=H; R2=0; R3=R.i=OH
Los resultados de las actividades citotóxicas (Tabla 1) de los compuestos 1-4 muestran que
las diferentes funcionalidades en el anillo E afectan a la actividad y a la selectividad.
También se observa en la misma tabla que los productos 7-hidroxi y 7-oxotriterpeno­metilenquinónicos
5-8, tienen muy baja citotoxicidad, quedando de manifiesto la
importancia de la extensión de la conjugación a través del anillo B.
Tabla l. Actividad citotóxica frente a líneas celulares (ICSO μM) de I-8.
{l) {2) {3 {4} {S} {6} {7} {8}
P-388 0.22 0.22 0.26 0.24 5.73 11.41 1.10 5.50
A-549 0.54 0.27 0.26 0.60 11.47 11.41 2.21 11.0
HT-29 1.10 0.27 0.26 0.60 11.47 11.41 2.21 11.0
MEL-28 1.10 0.27 0.26 0.60 11.47 11.41 2.21 11.0
P-388: mouse lymphoma (ATCC:CCL 46); A-549: human lung carcinoma (ATCC:CL85);
HT-28: human colon carcinoma (ATCC: HTB38); MEL-28: human melanoma (ATCC:HTB72).
A-b) Quimioteca de análogos de triterpeno-quinonas
El diseño de los análogos de triterpeno-quinonas está basado en la estructura
modular de este tipo de productos, los cuales poseen dos zonas hidrofilicas centradas en los
anillos A y E, que contienen grupos aceptares y dadores de enlaces de hidrógenos,
respectivamente. También tienen una parte hidrofóbica localizada en los anillos B, C y D, y
el carbono C-6 puede actuar como aceptor de Michael (Figura 4).
Figura 4
Hydrophobic part
Considerando este esquema de reactividad, decidimos estudiar la influencia sobre la
actividad antitumoral de varias modificaciones sobre el esqueleto. En la Figura 5 y en la
Tabla 2 se muestran los resultados obtenidos con acilaciones selectivas sobre el hidroxilo
en el carbono C-3 del compuesto 1.
92
a
HO
Figura 5
o
OH 1.5 eq RCOCI
3 eq Et3N a
o (9) R=COCH3
(10) R=CO(CH2)2CH3
(11) R=COCH(CH3)2
(12) R=CO(CH2)10CH3
(13) R=CON(CH3)2
(14) R=nicotinoyl oxi
(15) R=CO-Ph(OMe)J
(16) R=COp-NCiPh
(17) R=S02PHMe
Tabla 2. Actividad citotóxica frente a líneas celulares (ICSO μM) de 9-17
P-388 A-549 HT-29 Mel-28 P-388 A-549 HT-29 Mel-28
1 0.22 0.54 1.10 1.10 13 0.20 0.99 0.99 0.99
9 0.52 1.04 1.04 1.04 14 1.84 1.84 1.84 1.84
10 2.03 2.03 15 1.59 7.94
11 10.2 10.2 16 17.0 17.0 17.0 17.0
12 0.40 1.62 1.62 1.62 17 0.85 1.69 1.69 1.69
P-388: mouse lymphoma (A TCC:CCL 46); A-549: human lung carcinoma (A TCC:CL85);
HT-28: human colon carcinoma (ATCC: HTB38); MEL-28: human melanoma (ATCC:HTB72).
Otros tipos de acilaciones, usando diferentes condiciones de reacción, se
consiguieron vía adición de Michael en el carbono C-6 y posterior acetilación del sistema
catecol generado. Los productos obtenidos y su propuesta de formación se muestran en las
Figuras 6 y 7. y los resultados de actividad antitumoral en la Tabla 3, donde también se
muestran como patrones de referencia los datos de algunos antitumorales utilizados en
clínica. A la luz de la tabla puede observarse como alguno de nuestros productos presentan
mejores citotoxicidades que cis-platino. etoposido o taxol y en el caso del compuesto 21
meior selectividad aue vinblastina.
Figura 6
(18) R1=H; R2==0; RJ=OAc
(21) R1=C00Me; R2=R3=H
(24) R1=COOMe; R2=0Ac; R3=H
(27) R1 =R3=H; R2==0
OH
(19) R1=H; R2==0; RJ=OH
(22) R1=COOMe; R2=R3=H
(25) R1=COOMe; R2=0H; R3=H
(28) R1=R3=H; R2==0
93
(1) R1=H; R2==0; RJ=OH
(2) R1=COOMe; R2=R3=H
(3) R1=COOMe; R2=0H; R3=H
(4) R1=R3=H; R2=0
OCH2CH3
(20) R1=H: R2==0; R3=0H
(23) R1=C00Me; R2=R3=H
(26) R1=COOMe; R2=0H; RJ=H
Figura 7
AcWº.rv\111
... ~ 1 1
Ac
OAc
trans-esterification ... Ac~~
~ 1 1
A e O
OH
Tabla 3. Actividad citotóxica frente a líneas celulares (IC50 μM) de 12-28.
Compounds P-388 A-549 HT-29 MEL-28
1 0.22 0.54 1.10 1.10
2 0.22 0.27 0.27 0.27
3 0.26 0.26 0.26 0.26
4 0.24 0.60 0.60 0.60
18 0.17 0.43 0.86 0.86
19 17.2 17.2 17.2 17.2
20 0.16 0.82 0.82 0.82
21 0.044 0.18 0.18 0.18
22 2.22 2.22 2.22 2.22
23 0.21 0.84 1.68 0.84
24 0.19 0.19 0.19 16.0
25 16.0 16.0 16.0 16.0
26 0.15 0.15 0.15 0.19
27 0.23 0.23 0.23 0.23
28 19.0 19.0 19.0 19.0
Cis-J!latinum 8.33 16.67 33.33 33.33
Etoposide 0.17 0.17 1.70 0.85
Vinblastine 0.022 0.022 0.022 0.022
Taxol 0.59 0.012 0.012 0.012
P-38801: Mouse lymphoma (ATCC CCL-46); AT-549: Human lung carcinoma (A TCC CCL-185 );
HT-28: Human colon carcinoma (ATCC HTB-38); SK-MEL-28: Human melanoma (ATCC HTB-72).
En la Figura 8 se muestran los productos 29-36 obtenidos por benzoilación del
producto 1, los cuales fueron menos activos, indicando que el tamaño del grupo acilo
localizado en los anillos A y E juega un papel significativo en la actividad, y que los efectos
electrónicos presentes en el anillo aromático son irrelevantes.
94
RO
RO
OH
(29) R=p-Br-Bz
(32) R=p-N02-Bz
(35) R=Bz
·OR
RO
RO
Figura 8
OH
(30) R=p-Br-Bz
(33) R=p-N02-Bz
(36) R=Bz
·OR
R
OCH2CH3
(31) R=p-Br-Bz
(34) R=p-N02-Bz
(37) R=Bz
En la Figura 9. se muestran las estructuras de los productos obtenidos mediante
modificaciones realizadas sobre el carbonilo y el hidroxilo localizados en el anillo E,
(productos 38-43) y los correspondientes resultados de actividad citotóxica en la Tabla 4. El
único producto interesante de esta serie resultó ser el compuesto 38, obtenido por
sustitución del grupo carbonilo por una oxima, que incrementó la actividad frente a las
líneas celulares A-549 en dos veces, y en cuatro veces para las líneas celulares HT-29 y
MEL-28.
Figura 9
*OH
H (40)
~ OH
~4
* ~~ HO
ºo Y
0~0H
:t~;~ o (41)
DCC,Py, E/ u;g"o O
*o \ 0~0Et
H O O (42) \ ~N-0
HrlrNHOH
OH \~OH
NH~~Traces
l20H.HCI ~ NOH
H
\ OH (38)
j ¡
NOAc
O A e
Ac
ó
95
Las oxidaciones de los productos 1-4 bajo diversas condiciones,6
•
9 nos condujeron a
los productos 44-53 (Figura 1 O) cuyos datos de citotoxicidad se muestran en la Tabla 5,
siendo significativos algunos de ellos, con actividad similar a la de Etoposido, también
incluido en dicha tabla.
Tabla 4. Actividad citotóxica frente a líneas celulares (IC50 μM) de 38-43.
P-388 A-549 HT-29 Mcl-28 P-388 A-549 HT-29 Mel-28
l 0.22 0.54 1.10 1.10 39 0.16 0.16 0.16 0.16
2 0.22 0.27 0.27 0.27 40 0.23 0.23 0.23 0.23
3 0.26 0.26 0.26 0.26 41 0.93 1.87 0.93 0.22
4 0.24 0.60 0.60 0.60 42 0.08 0.44 0.44 0.44
38 0.22 0.27 0.27 0.27 43 0.13 0.13 0.13 0.33
P-38801: Mouse lymphoma (A TCC CCL-46 ); AT-549: Human lung carcinoma (A TCC CCL-185 );
HT-28: Human colon carcinoma (ATCC HTB-38); SK-MEL-28: Human melanoma (ATCC HTB-72).
HO
~
(44) R1=R=H; R2= =O: R3=0H
(46) R1=H; R2= =O; R3=0H; R=Me
(47) R1=R3=R=H: R2= =O
(48) R1=R3=H; R2= =O: R=Me
(50) R1=COOMe; R2=R3:::R=H
(51) R1=COOMe; R2=R3=H: R=Me
(53) R1::CQOMee; R2::::0H; R3=H; R::Me
(1) R1=H; R2= =O; R3=0H
(2) R1=R3=H; R2= =O
(3) R1=COOMe; R2=R3=H
(4) R1=COOMee; R2=0H; R3=H
(45) R1=H; R2= =O; R3=0H
(49) R1=R3=H; R2= =O
(52) R1=COOMe; R2=R3=H
Figura 10
Tabla 5. Actividad citotóxica frente a líneas celulares (IC50 μM) de 46, 48, 51 y 53.
P-388 A-549 HT-29 MEL-28 P-388 A-549 HT-29 MEL28
0.17 0.17 1.70 0.85 44 2.21 2.77 2.77 2.77
Etp
l 0.22 0.54 1.10 1.10 46 0.11 0.54 0.54 0.54
2 0.22 0.27 0.27 0.27 48 0.06 0.56 0.56 0.56
3 0.26 0.26 0.26 0.26 51 0.10 0.20 0.20 0.20
4 0.24 0.60 0.60 0.60 53 0.24 0.98 0.98 0.98
P-38801: Mouse lymphoma (ATCC CCL-46); AT-549: Human lung carcinoma (ATC'C C'CL-185);
HT-28: Human colon carcinoma (ATC'C HTB-38); SK-MEL-28: Human melanoma (ATCC HTB-72).
A continuación mostramos los resultados obtenidos en la preparación de
compuestos que presentan una extensión de la estructura a partir de un compuesto
dicarbonílico 46 o bien por reacciones de hetero-Diels-Alder con demanda inversa de
electrones de los compuestos 1 y 2 frente a bromanilo, Figuras 11 y 12. La actividad
citotóxica se muestra en la Tabla 6.
96
(56)
54
55
56
57
Figura 11
Figura 12
R1 =H; R2==0; R3=0H
R1=C00Me; R2=R3=H
(57)
o
~
l~w.I\ ~ ~ N .,
J!i NOE 'OMe
~
(55)
Tabla 6. Actividad citotóxica frente a líneas celulares (IC50 μM) de 1-8.
P-388 A-549 HT-29 MEL-28 P-388 A-549 HT-29 MEL28
17.6 17.6 17.6 17.6 58 0.14 0.14 1.16 0.58
1.50 1.50 _] .50 1.50 59 0.14 0.14 1.16 0.58
0.20 0.98 0.98 0.98 60 0.14 0.28 0.56 0.56
0.17 0.90 0.90 0.90 65 0.22 0.22 1.79 0.90
P-388: mouse lymphoma (ATCC:CCL 46); A-549: human lung carcinoma (ATCC:CL85);
HT-28: human colon carcinoma (ATCC: HTB38); MEL-28: human melanoma (ATCC:HTB72).
97
En la figura 13 se observan otras transfonnaciones químicas selectivas que a partir
del producto 1 nos condujeron a los productos 62-65. Los resultados de actividad se
encuentran también en la Tabla 6.
Figura 13
a~"""" ~' 0
1 ~a
~ CN ""
eN ;¡.º~ ~,._ ' 1 ¿
Molec~ar
O Sieves (62)
CN (64) OH
A-e) Nor-catecol-triterpenos antitumorales:
En la Figura 14, se muestran las estructuras de catecoles de origen natural, éstos son
productos menos abundantes que las triterpenoquinonas. En la Tabla 7 se puede observar
que son menos activos que los metilén-quinónicos correspondientes. En este tipo de
compuestos, la presencia de un grupo carbonilo en el carbono C-6 parece ser crítica para la
actividad. Compuestos sin grupo carbonilo en C-6 presentan aún más baja actividad. En un
intento de de establecer el papel de los diferentes grupos situados en el anillo aromático así
como el del grupo carbonilo sobre C-6 realizamos algunas modificaciones sobre el más
activo de los fenoles aislados hasta el momento, el producto 70, obteniéndose los
compuestos 78-82 (Figura 15) y los datos de citotoxicidad se muestran en la Tabla 8. De
estos datos se deduce que la introducción de grupos metoxilo disminuye la actividad
mientras que la acetilación genera compuestos más activos.
98
Figura 14
o
HO HO
HO HO
CHOO
o o
OH
H HO
HO
CHO
o o
OH OH OH
HO H
HO
CHO
o
OH OH
H H
H
f!t o
Tabla 7. Actividad citotóxica frente a líneas celulares (IC50 μM) de 1-8.
P-388 A-549 HT-29 Mel-28 P-388 A-549 HT-29 Mel-28
66 10.37 10.37 10.37 I0.37 72 5.55 11.11 11.11 11.11
67 1.00 0.20 2.02 1.00 73 20.16 20.16 20.16 20.16
68 11.42 11.42 22.83 22.83 74 2.15 2.15 2.15 2.15
69 23.04 23.04 23.04 23.04 75 5.71 5.71 5.71 5.71
70 0.54 0.54 1.07 1.07 76 5.51 5.51 5.51 5.51
71 5.19 5.19 5.19 5.19 77 8.74 8.74 8.74 8.74
P-388: mouse lymphoma (ATCC:CCL 46); A-549: human lung carcinoma (ATCC:CL85);
HT-28: human colon carcinoma (ATCC: HTB38); MEL-28: human melanoma (ATCC:HTB72).
99
Figura 15
o
OH
OH OH
CHOO H
CHO
~Cl3
H
(70)
CHOO
o o
O A e
+
(78) CHOO (79)
Tabla 8. Actividad citotóxica frente a líneas celulares (IC50 μM) de 1-8.
P-388 A-549 HT-29 MEL-28 P-388 A-549 HT-29 MEL-28
70 0.54 0.54 1.07 1.07 80 9.58 9.58 9.58 9.58
78 0.20 0.20 0.42 0.42 81 5.06 5.06 5.06 5.06
79 0.18 0.22 0.22 0.22 82 1.08 1.08 2.17 1.08
P-388: mouse lymphoma (ATCC:CCL 46); A-549: human lung carcinoma (ATCC:CL85);
HT-28: human colon carcinoma (ATCC: HTB38); MEL-28: human melanoma (ATCC:HTB72).
A-d) Mecanismo de acción
El mecanismo de acción de estos compuestos no ha sido aún del todo establecido.
Sin embargo nosotros proponemos un mecanismo plausible para las triterpeno-quinonas y
triterpenofenoles. Así ellos pueden interactuar con grupos nucleófilos, (:Nu) de la diana
molecular vía una adición de Michael en las quinonas o vía una adición nucleofilica a C-6
en catecoles, o vía sustitución nucleofilica en triterpenos con sustituyentes en el carbono C-
6 que puedan actuar como buenos grupos salientes. Nuestra hipótesis ha sido reforzada por
los trabajos de Setzer30 que llevaron a cabo usando cálculos semiempíricos tipo PM3 y
Hartee-Fock 3-2IG ab initio con tingenona (4) y las bases de nucleótidos adenina, guanina
citosina y timina, sugiriendo para la tingenona una interacción casi intercalante con el ADN
seguida de una adición nucleofilica de las bases del ADN a la posición C-6 del triterpeno.
~ OH~' H°XXY\
HO~ OH~ HO ( ~ L:Leavlng group
:Nu-Target :Nu-Target :Nu-Target
Michael Addittion Nucleophilic Addittion Nucleophilic Substitution
100
A-e) Resumen de relaciones Estructura-Actividad
Considerando toda la infonnación obtenida, hemos elaborado unas conclusiones que
pueden pennitimos prever la citotoxicidad de un producto de esta familia.
En trite1penos metilen quinónicos la actividad se ve incrementada con:
• La presencia de conjugación extendida de dobles enlaces en el anillo
• La presencia de carbonilo en C-2
• Con la existencia de grupos éster pequeños como sustituyentes en el
carbono C-3
En trite1penos fenoles la actividad se ve aumentada con:
• La presencia sobre el carbono C-6 de un grupo carbonilo u otros
sustituyentes (por ejemplo, OH, SCH2PH ..... )
• En compuestos con grupo carbonilo sobre C-6, la presencia de un
doble enlace C-7-C-8 o la presencia de un sustituyente atractor de
electrones, o las dos cosas a la vez.
• En catecoles sustituidos en C-6 la estereoquímica a. y sustituyentes
pequeños en el anillo A.
Como resultado de estas investigaciones varios productos han sido
seleccionados para estudios más avanzados por el Instituto Nacional del Cáncer de
EE UU y se encuentran protegidos bajo patente31
•
A-t) Nuevos derivados benzotropolónicos como lesionantes específicos de ADN.
El cáncer muestra y acumula un gran número de cambios genéticos durante el
progreso hacia su malignización debido a una inestabilidad genética intrínseca. Estas
alteraciones genéticas suelen afectar a la reparación del ADN y a las rutas de chequeo del
ciclo celular que incrementan la sensibilidad de las células tumorales con respecto a los
agentes lesionantes para el ADN.
Por ello, recientemente hemos iniciado un proyecto de búsqueda de productos
naturales y sintéticos con capacidad de producir daño al ADN.
Así, en un estudio de la especie Goupia glabra ( Celastraceae),32 distribuida en la
zona amazónica de Perú y comúnmente conocida como "capricomia", "copiuba" y "muena
rifarillo", aislamos dos nuevas sustancias que denominamos goupiolona A (83) y
goupiolona B (84), con novedosas estructuras de tropolona y de aducto Diels-Alder
benzotropolona. Las estructuras se muestran en la Figura 16.
En los ensayos se utilizó un panel de cepas de la levadura Saccharomyces
cerevisiae, mutantes para cada uno de los genes implicados en las rutas de control del ciclo,
que responden a lesiones en el ADN.
Se cuantificó la concentración inhibitoria al 50% (ICso) para cada compuesto y
también para el antineoplásico doxorubicina en la cepa silvestre (WT) y en la cepa mutada
rad9, como representante del panel.
En la Tabla 9 se observa que los compuestos goupiolona A y goupiolona 8 son 50 y
16 veces más citotóxicos para rad9 que para la cepa silvestre y que ninguno muestra
toxicidad significativa hacia la cepa silvestre a una concentración superior a 100 μg/ml. Los
compuestos presentan también mayor citotoxicidad que la doxombicina, lo cual indica que
inducen muerte celular por lesiones en el ADN y que se comportan como genotóxicos.
resaltando su potencial como moléculas anticancerígenas.
101
Figura 16
OH
OH
OH
Tabla 9: Valores de IC50 (μg/ml) para 83, 84 y doxorubicina en la cepa silvestre y en la cepa
mutante Rad9.
83 84 doxorubicina
Cepa silvestre >IOO >100 >100
Mutante Rad9 2 6 12.5
Este mismo método se ha aplicado a naftoquinonas y han sido recogidos en una
tesis doctoral. 33
B) Actividad quimiopreventiva del cáncer
En 1980 Doll y Peto34 indicaron que aproximadamente el 10% de los cánceres eran
causados por agentes infecciosos. Los agentes responsables ordenados por el número de
casos producidos son: la bacteria Helicobacter pylori, VIH, virus Epstein-Barr (VEB),
esquistosomas, virus HTL- I y trematodos de hígado34
•
Hoy se sabe que los virus de la hepatitis B y C, el virus del papiloma humano, el
virus linfotrópico-T y el virus Herpes humano 8 han sido incluidos como agentes
infecciosos para los cuales existen evidencias razonables de causalidad con respecto a uno o
más neoplasmas.
El virus de Epstein-Barr (VEB) es un y-herpes que se encuentra presente en todos
los humanos y que esta relacionado con algunos tipos de linfomas tales como el linfoma de
Burkitt y el de Hodgkin, con algunos carcinomas como el nasofaríngeo y también se asocia
con la mononucleosis infecciosa, comúnmente llamada enfermedad del beso35
•
Para el linfoma de Burkitt (BL), el genoma del virus de Epstein-Barr está presente
en células tumorales aproximadamente un 95 % de los casos en África Sub-Sahariana, un
85 % en los casos de África del Norte y entre 1/5 y l /3 de la población en el norte de
América y Europa. La fracción en América Latina esta indeterminada. Esta proporción
representa los casos de linfoma de Burkitt en distintas áreas atribuido al VEB. Para la
enfermedad de Hodgkin, el ácido nucleico del VEB está presente entr 30 y 50 % de los
tumores, pero la relación depende de la edad (el 70 % de los casos en la infancia, 20% en
jóvenes adultos y el 70 % de los grupos de avanza ed.ad). El VEB está presente en la
mayoría de los casos de carcinoma nasofaríngeo indiferenciado (CNF). Este tipo
comprende la gran mayoría de cáncer en la población de alto o medio riesgo. En las áreas
de más bajo riesgo, sobre 10-25 % de CNF es del tipo 1 (queratinizante), que pocas veces
infecta. Hemos asumido que el I 00% del carcinoma nasofaríngeo indiferenciado en áreas
de alto y medio riesgo ( ASR>2.0 en hombres, 1.0 en mujeres) se relaciona con el VEB y el
90% de los casos de bajo riesgo34
•
102
Nuestros esfuerzos se dirigen a la búsqueda de nuevos metabolitos secundarios
(productos naturales) capaces de impedir la inducción de cáncer. Actualmente no existe
ningún fármaco eficaz frente al Virus de Epstein-Barr, pero si se ha demostrado que
diferentes tipos de productos naturales presentan actividad antiEromotora de tu1!1ores.
Algunos ejemplos los constituyen los carotenoides36
• sesquiterpenos 7 y antraquinonas->8
•
Con estos antecedentes decidimos evaluar el potencial quimiopreventivo de una
amplia variedad de naftoquinonas y sesquiterpenos.
Dichos ensayos consisten en la incubación de células Raji, derivadas de linfomas de
Burkitt que soportan el virus de Epstein-Barr, junto con phorbol (TPA), promotor de la
actividad oncogénica del virus y diferentes cantidades de los compuestos cuya actividad
queremos determinar. Mediante técnicas indirectas de inmunofluorescencia se determinó el
porcent~e de inducción de antígenos tempranos del VEB, responsables de la iniciación de
tumores 0
.
Hasta el momento presente hemos evaluado la actividad de un total de diecisiete
naftoquinonas, de diferentes tipos, furano y piranonaftoquinonas angulares); lineales,
naftoquinonas sencillas y derivados con nitrógeno y otros heteroátomos41 3
• Se han
estudiado quince sesquiterpenos con esqueleto básico de dihidro-~-agarofurano, cinco de
ellos con estructura polihidroxilada tipo 8-epi-4~-hidroxialato138•44 , seis con esqueleto de
2a,4~-dihidroxi-celorbicol, dos de ellos con esqueleto de 3-deoximaitol, uno de la serie de
la eunominina y uno de la serie 4~-dihidroxi-celorbicol .
B-a) Actividad quimiopreventiva de productos que contienen sistemas aftoquinónicos.
Las especies que contienen lapachol (1), una prenilnaftoquinona aislada de la
madera de Tabebuia impetiginosa (Bignoniaceae)45 y algunas naftoquinonas
biológicamente relacionadas (por ejemplo: tahaebo, pau d'arco y lapachoroxo) se han usado
generalmente en la medicina popular iberoamericana para el tratamiento del cáncer y de
infecciones46
• Por ello nos pareció interesante evaluar el posible potencial quimiopreventivo
de una serie de derivados naftoquinónicos obtenidos a partir de lapachol (1) por reaciones
de acilación, ciclación o modificación en la cadena lateral41 (Figura 17).
103
(96)
Figura 17
o
C-ÓQ:º
(93)
(86)R=Me
(87)R=o-
~ D Br
(88) R=(CH2)10CH3
(89) R= CHN2COEt
(94)
o
(97) R=H
(98) R=COCH3
(95)
Los resultados obtenidos se encuentran recogidos en la siguientes referencias 40-42 y 45.
Del análisis de dichos datos se puede deducir que los compuestos 86, 90, 91, 92 y 99
actúan como valiosos agentes en la quimioprevención del cáncer.
104
Tabla 1 O: Porcentajes de inducción de antígenos tempranos
de virus Epstein-Barr en presencia de los compuestos 85-101.
Compuesto 1000 500 100 10
85 17.5b (70) 44.6 63.6 97.8
86 o (70) 22.7 56.0 82.l
87 21.3 (70) 48.0 71.9 100
88 17.3 (60) 49.5 76.9 100
89 16.9 (60) 46.7 72.5 100
90 2.5 (70) 33.8 61.3 89.3
91 4.7 (70) 35.2 62.4 90.2
92 5.2 (70) 38.5 63.7 91.7
93 14.7 (60) 45.9 71.6 IOO
94 23.6 (60) 50.3 73.9 100
95 19.9 (70) 47.8 68.5 100
96 20.7 (70) 49.7 73.7 100
97 10.5 (60) 42.2 66.2 94.8
98 12.3 (60) 40.6 63.9 92.9
99 7.7 (60) 40.8 65.0 92.5
100 15.7 (60) 43.l 68.2 96.3
101 14.6 (60) 41.7 64.0 94.7
(3- 8.6 (70) 34.2 82.1 100
caro ten o
Los valores entre paréntesis representan los porcentages de viabilidad de células Raji.
Relación molar/TPA (32 pmol=20 ng/ mL), 1000 rmol = 32 nmlo, 500 rmol= 16 nmol, 100
rmol = 3 .2 nmol y 1 O rmol = 0,32 nmol. Los valores representan los porcentages de
inducción de A T-VEB, en la presencia de los compuestos relativos a un control 1 OO.
A continuación mostramos conclusiones sobre relaciones Estructura-Actividad
a) Modificaciones del grupo hidroxilo
Los derivados 86-89 fueron obtenidos mediante reacciones de acilación de lapachol
y una variedad de agentes de distinta lipofilia y carácter estereoelectrónico. Los derivados
87, 88 y 89 presentan actividades similares al lapachol. El derivado acetilado 86 resultó ser
más activo que 85, resultando más efectivo que el 13-caroteno. un precusor de la vitamina A
que ha sido ampliamente estudiado en la prevención del cáncer usando animales.
Concluyéndose que la introducción en el grupo hidroxilo de grupos aceptores de puentes de
hidrógeno conduce a derivados activos cuando dicho grupo no es voluminoso.
b) Modificaciones en la cadena lateral
El compuesto 90, que presenta una cadena lateral con un átomo de carbono menos y
fue obtenido a partir de 85 por oxidación de Hooker48 mostró una importante actividad
inhibitoria ( 1O,7% de la inhibición fue inducida a 1 O mol ratio/TPA). Las modificaciones
sobre la cadena lateral del compuesto 86 llevaron a los compuestos 91, 92 y 93, la activ
idad de estos derivados es mejor que la del lapachol pero no es mejor con respecto
al derivado acetilado 86. La sustitución del doble enlace en la cadena lateral isoprenílica
por diferentes funcionalidades produce un descenso de la actividad inhibitoria. esto indica
que la presencia del doble enlace en los derivados tipo 1,4-naftoquinona es necesaria para
conseguir unos buenos niveles de actividad inhibitoria.
105
c) Modificaciones en el C-1 del grupo carbonilo
La reacción de 85 con hidroxilamina/ HCI proporcionó el producto 95, el cual se
acetiló para dar 96. Los compuestos 95 y 96 fueron bastante menos activos que el lapacho(,
indicándonos que la presencia del grupo carbonilo en la posición 85 es imprescindible para
la actividad quimiopreventiva.
d) Reacciones de cic/ación
El tratamiento de 85 con AMCPB rindió vía un intermedio tipo epóxido la orto­dihidrofuranoquinona
angular 97, el derivado pirano 98 y la 1,4-naftoquinona lineal 99. El
derivado J3-lapachona 100 y su isómero a se obtuvieron por tratamiento de 85 con HiSO.i
vía un intermedio catiónico. Los derivados tricíclicos, tanto lineales como angulares,
presentaron buenas actividades, en especial los del tipo furano. Con respecto a los anillos
de seis miembros, el que presentó mejor actividad fue el producto 98, que posee un grupo
hidroxilo. Los compuestos 97, 98 y 99 tienen el sistema o-quinona a diferencia del
lapachol. En general, el aumento de planaridad en la molécula produce mejoras en la
actividad quimiopreventora de tumores.
8-b) Actividad quimiopreventiva de productos con esqueleto de sesquiterpeno.
Otros compuestos que han presentado una importante actividad antipromotora de
tumores son los sesquiterpénos agarofuránicos. Este tipo de productos se aislan de la
familia Celastraceae, pudiéndose considerar marcadores quimiotaxonómicos de la misma.
Alguno de ellos han mostrado importantes bioactividades como el evitar que se produzcan
resistencias a fármacos como daunomicina en líneas celulares de leishmania43ª con fenotipo
de resistencia.
En nuestro laboratorio hemos aislado y caracterizado varias decenas de estos productos
y hemos publicado diversos trabajos sobre la determinación de la configuración absoluta de
nuevos sesquiterpenos con esqueleto de dihidro-J3-agarofurano, que en algún momento ha
generado controversias y al cual le hicimos una im,&ortante aportación con estudios de
dicroísmo circular que definitivamente evitaron dudas b.
Así de la especie Crossopetalum tonduzii, una planta procedente de Panamá, hemos
aislado los sesquiterpenos 102-106 (ver Figura 18). Para la elucidación estructural hemos
usado datos espectroscópicos de Resonancia Magnética Nuclear 1H y 13C, correlaciones
HSQC, HMBC y ROESY.
/OMetBu
QA~ QBz
HO,,~OAc
~\
102 OAc
l B.Cllpy
/OMetBu
QA<s QBz
BzO/.~OAc
~\
OAc
104
Figure 18
106
/OMetBu
QA~ QBz
Aco,..~OAc
~\
O A e
105 t A,,01py
/OMetBu
QA<s QBz
AcO,..~OAc
~\
OH
103 R=H
106 R=Ac
Jj
Los compuestos 102-106 fueron evaluados para determinar su actividad
quimiopreventiva inducida por TP A. Los datos de actividad obtenidos se recogen en la
Tabla 11.
Tabla 11: Porcentajes de inducción de antígenos tempranos de virus Epstein-Barr en presencia de
los compuestos 102-106.
Concentración
(molratio/TPA)ª 102 103 104 105 106 ~-
ca rote no
1000 0° (60) o (60) 4.6 (60) o (70) o (70) 8.6 (70)
500 31.2 32.7 33.8 22.0 21.8 34.2
100 73.7 74.0 75.9 79.2 77.4 82.1
10 90.56 90.I .9 6.. .0 96.7 .. 94.1 100 ºLos valores entre paréntesis representan los porcentages de viabilidad de células RaJI .
Relación molarffPA (32 pmol=20 ngl mL), IOOO rmol = 32 nmlo, 500 rmol= 16 nmol, IOO rmol = 3.2 nmol y 10 rmol =
0,32 nmol. "Los valores representan los porcentages de inducción de A T-VEB, en la presencia de los compuestos relativos
a un control 100.
Los compuestos 102, 103 y 106 presentaron fuerte actividad inhibitoria. Este trabajo
se encuentra publicado en la referencia 43.
En otro trabajo37 publicado en el año 2000 dimos cuenta del aislamiento de otros
sesquiterpenos de Maytenus cuzcoina. En total fueron 10 sesquiterpenos (107-116) (Figura
19) con esqueleto de dihidro-J3-agarofuránico, que también fueron ensayados para evaluar
su potencial quimiopreventivo (Tabla 12).
~Ac~ ~Fu
Ro,.,,~OAc
~\
OFU
107 R=Fu; 110 R=Bz
108 R=Ac 111 R=Pr
I09 R=H 112 R=McBut
115 Eumaitcnol
Figura 19
107
O A e
AcO.,, g¡~A~Rc ( OAc '· .
HO ··,.~O- ,,\\
O A e
113 R=Fu
114 R=Bz
OAC
OAc-:f OAC
~ ~ -::
116 Euoniminn
Tabla 12: Porcentajes de inducción de antígenos tempranos de virus Epstein-Barr en presencia de
los compuestos 107-116.
Concentración 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116
(molratioffPA)ª
1000 0°(70) o o 11.0(60) 6.3(70) o o 12.6(60) 10.5(70) 26.4(70)
(70) (70) (70) (70)
500 32.2 27.4 28.5 42.9 34.9 32.7 25.9 48.0 40.2 59.6
100 76.9 74.8 76.7 87.1 77.9 78.0 72.0 86.9 84.6 86.7
10 94.6 93.0 95.8 100 100 96.2 91.0 100 100 100
"Los valores entre paréntesis representan los porcentages de viabilidad de células Raji.
Relación molarffPA (32 pmol=20 ng/ mL), 1000 rmol = 32 nmlo, 500 rmol= 16 nmol, 100 rmol = 3.2 nmol y 10 rmol =
0,32 nmol.
bLos valores representan los porcentages de inducción de AT-VEB, en la presencia de los compuestos relativos a un
control 1 OO.
Los compuestos 107-109, 112 y 113 presentan fuerte actividad antipromotora de
tumores. Las actividades inhibitorias de estos compuestos son mayores que los productos
tales como glicirrhizina y ácido retinoico, los cuales se presentan como típicos promotores
antitumorales.
Nuestros resultados indican que nos encontramos con dos nuevas familias de
productos naturales cuyas prometedoras actividades nos obligarán en el futuro a
encontrar nuevos metabolitos relacionados, al igual que productos sintéticos más
potentes y selectivos.
Nuevos estudios de actividad inhibitoria de promotores de tumores se realizarán
sobre los productos de naturaleza naftoquinónica 86, 90, 91, 92, 99, los cuales resultaron
más potentes que el J3-caroteno.
Los compuestos 102, 103, 106-109, 112 y 113, todos ellos con un esqueleto
sesquiterpénico, y más potentes que los compuestos patrones conocidos, actualmente se
encuentran sometidos a estudios de investigación biológica en estadíos más avanzados.
También concluimos que los frutos de Maytenus cuzcoina podrían ser un efectivo recurso
de agentes preventivos. Estos resultados se encuentran recogidos en las referencias 37 y 43.
C) Actividad revertidora de la multirresistencia a fármacos
antitumorales
Muchos autores han considerado que leishmania es un excelente modelo para la
búsqueda de actividad antitumoral. Por eso, nuestros estudios se iniciaron con /eishmania y
se continuaron con cáncer.
En el caso específico de la leishmaniasis, una infección causada por diversas
especies del género leishmania, parásito protozoario quinetoplástido de la familia
Trypanosomatidae. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la leishmaniasis
se ha incrementado un 42% en los últimos 15 años, convirtiéndose en la segunda causa de
muerte producida por protozoarios a nivel mundia15º.
La ausencia de vacunas, así como la deficiencia en el control de los vectores, hace
que el empleo de la quimioterapia sea el arma más efectiva en la lucha contra estas
enfermedades infecciosas51
•
108
Hasta ahora, y desde 1940, las drogas más recomendadas y utilizadas son los
compuestos antimoniales pentavalentes, como meglumina antimoniato (Glucantime,
Aventis) y el estibogluconato de sodio (Pentostam, GlaxoSmithKline)52
"
54
• En la India,
alrededor del 50% de los casos de leishmania visceral son resistentes al Glucantime, debido
a la aparición de líneas de Leishmania donovani resistente a los compuestos antimoniales.
Existen fármacos alternativos o formulaciones conjuntas de fármacos, como la anfotericina
B liposomal, para leishmania visceral y paramomicina tópica, para leishmaniasis cutánea.
Sus mayores inconvenientes son el alto costo y escasa disponibilidad de las mismos55
•
Normalmente, son usadas cuando hay resistencia a los compuestos antimoniales.
Por otro lado, alquil-fosfolipidos (ALP), como la miltefosina y la edelfosina, han
demostrado una significante actividad antiproliferativa contra parásitos como Leishmania
spp., Tripanosoma cntzii y Tripanosoma bn1cei56
"
61
• La miltefosina es el primer fármaco
que, por vía oral, es altamente efectivo contra leishmaniasis visceral en la India, lo cual ha
sido demostrado en pacientes resistentes a compuestos antimoniales62
, incluyendo un caso
de un paciente con coinfección VIH/Leshimania63
•
La habilidad de las células cancerosas a desarrollar resistencia a fármacos
citotóxicos no relacionados estructural y funcionalmente, es denominada
multirresistencia a fármacos (MOR), lo cual ha constituido el principal impedimento
para el éxito de la quimioterapia64
•
Estos hechos hacen que en la últimas dos décadas, haya aumentado el interés por
los inhibidores de la glicoproteína-P como el principal mecanismo para revertir la MDR en
los cánceres65 o prevenir su aparición66
•
Tumores que no responden satisfactoriamente a la ~uimioterapia, han dado
respuesta positiva a tratamientos clínicos con moduladores MDR6
•
68
• Sin embargo, muchos
de estos moduladores que han demostrado actividad en los ensayos in vitro, han resultado
ser MOR en los pacientes, así como tóxicos a altas dosis69
•
La sobreexpresión de Pgp le provee a la célula resistencia contra un largo número
de fármacos hidrofóbicos antitumorales (fármacos MDR), como las antraciclinas,
actinomicina O, alcaloides de la Vinca, colchicina y taxanos, entre otros70
•
Según estudios etnobotánicos, extractos de plantas de la familia Celastraceae, han
sido usadas por siglos en la medicina tradicional
C-a) Actividad revertidora de sesquiterpenos dihidro-Ji-agarofuranos
Recientemente, hemos publicado que sesquiterpenos con esqueleto dihidro-13-
agarofurano son buenos moduladores del fenotipo MDR en células eucariotas, revirtiendo
significativamente la resistencia a Pgp de los transportadores de daunomicina.
De las partes aéreas de Crossopetalum tonduzii se han aislado ocho compuestos de
esta serie, cinco de los cuales se han publicado por primera vez en la literatura científica,
(Tabla 13), y un noveno compuesto de Maytenus macrocarpa (R. and P.) Buquet, los cuales
son efectivos en la reversión de la resistencia de la daunomicina (DNM) en una línea MDR
de L. tropica. y su unión al dominio enlazante C-terminal del nucleótido recombinante
(NBD2) de transportadores Pgp de Leishmania, lo cual ha permitido un mayor
entendimiento sobre el modo y sitio de acción molecular de estos compuestos en las Pgpn.
Igualmente, derivados de esta serie fueron aislados de las raíces de Ce/astn1s orbiculatus. y
resultaron efectivos como revertidores completos o parciales del fenotipo MOR en células
cancerosas 73
.
109
Tabla 13. Afinidad enlazante a Leishmania NBD2° de los sesquiterpenos 118-126, aislados de
Crossopetalum tonduzi, y 127 de Maytenus macrocarpa
Compuest R1 R2 R3 R4 R5 R6 % a 50μMb
o ----~-----
OH ONic OH poAc aOBz OMeBut 31.1
118
119 OAc OAc OAc POAc aOBz OMeBut 22.8
120 OAc OAc OH POAc aOBz OMeBut 30.8
121 OAc OAc OAc aONic POBz OMeBut 31.8
122 O A e H OAc aONic POBz OMeBut 34.3
123 OBz OH OAc POAc aOBz OMeBut N.O.
124 OBz OH OH POAc aOBz OMeBut 31.4
125 OAc OH OH p OMeBut aOBz OMeBut 27.5
126 O A e H O A e ~OAc aOBz OAc 27.0
0
EI dominio NBD2 fue incubado, bajo condiciones previamente descritas en la parte experimental. de la referencia 72.
b
La disminución de fluorescencia intrínseca fue representado como una función de la concentración, y el apagado producido a
SOμM fue determinado gráficamente. N.D., no determinado debido a la alta fluorescencia intrínseca de este compuesto.
Por otro lado, del extracto de la corteza de las raíces de dos plantas chilenas del
género Maytenus (Celastraceae), se han aislado diez nuevos compuestos con esqueleto
dihidro-p-agarofurano, además de siete compuestos publicados previamente por otros
autores, M magellanica (1-14), y M chubutensis (15-17) (Figura 20). Catorce de estos (1-3
y 6-16), fueron analizados en la sobreexpresión de los transportadores de Pgp en L. tropica,
con el fin de determinar su habilidad para revertir la resistencia al fenotipo, así como para
modular la acumulación intracelular de fármacos74
• De esta serie, los compuestos 1, 2, 3, 14
y 15 mostraron una actividad muy potente, siendo 1 el más activo de todos (Tabla 14).
110
Figura 20. Sesquiterpenos aislados de Maytenus magellanica y Maytenus chubutensis
HO
11
""º
1: R
"'()Bz
1 t ~
·~
1 R=OC'in
2 R= OBz
Ni:O •' R
;,
6 R-OCin
7 R= OR1
IO ll- OH1
ti R-• 01\c
'
'"0111
,. OBz
R "0Ac
BzO
t. NicO ª •<"--oAc
14 R~ OH
IS R~ 11
3
,. OBL
"0Bz
AcO OAc t NrOJ
12
HO I! OBz
AcO .
t ª 1$
16
111
.' •OBz
HO
4 R=OAc
5 R=OH
BzO 1i ~~Ni:
;¡ : OAc
¡, ,:,
13
~.J~Ac
Ac0..tt±t7'
i. '~ª ª Aca-- OAc
17
Inhibición del Crecimientoª (%)
30
Com 7,SμM μM IS μM
p Wt DNM-Wt
DNM- Wt DNM-RISO
RISO RISO
7.S ± 7.S 94.3 ± 7.3 ± 8.9 92.8 ± 3.6 o.o± o.o 88.2 ± 6.7
3.5
2 13.3 ± 94.0± 4.1 ±5.8 89.7 ± 7.5 5.3 ± 7.4 82.0 ± 9.2
14.6 2.6
3 7.5 ± 7.3 94.7± 3.7±4.7 90.3 ± 7.2 2.5 ± 3.5 82.0 ± 1.7
2.2
1.9 ± 2.0 45.0± 1.5±2.1 13.5 ± 3.5 1.5 ± 2.1 7.3 ± 4.4
6 10.0
7 3.7± 2.9 69.5 ± 0.7± 0.9 30.7 ± 1.1 2.2 ± 3.1 10.0 ± 4.3
0.7
8 11.0± 7.6 89.0± 6.0±2.8 54.0 ± 6.5 0.5 ± 0.7 23.9 ± 5.7
o.o
9 19.7±4.1 69.7± 12.9 ± 44.0± O.O± O.O 21.4 ± 9.4
10.1 5.4 15.6
JO 20.5 ± 7.2 93.0± 15.8 ± 79.0 ± 8.5 0.5 ± 0.7 48.7 ± 9.0
1.4 6.8
11 23.0 ± 2.0 90.0± 14.4± 65.0 ± 6.4 1.7±2.3 39.0 ± 8.4
4.2 20.4
12 13.3 ± 94.5 ± 13.0± 79.3 ± 10.7 1.7 ± 1.0 42.2 ± 9.8
13.0 2.1 2.8
13 16.2 ± 1.9 92.0± 19.7 ± 82.2 ± 12.1 9.7± 2.3 60.3 ±
2.8 6.6 10.2
14 45.0± 94.8± 25.8 ± 91.3 ± 7.0 8.2 ± 8.2 80.7 ± 9.0
10.0 3.6 1.7
15 35.0± 93.7± 27.5 ± 87.9 ± 9.9 11.5 ± 83.7 ±
JO.O 3.5 7.7 0.7 6.1
16 11.7 ± 3.7 77.5 ± 3.S ± S4.0 ± 14.5 O.O± O.O 32.0±
11.3 4.9 11.6
Tabla 14. Efecto de los Sesquiterpenos de M magellanica y M chubutensis en la Citotoxicidad
de DNM en una Línea MOR de L. tropica Line
ªParásitos Silvestres (WT) y parásitos MOR (DNM-R 150) fueron expuestos a 30, 15 y 7.5
μM de diferentes sesquiterpenos, en ausencia o presencia de 150 μM DNM,
respectivamente. Los resultados son expresados como porcentaje de la inhibición del
crecimiento relativa al crecimiento del control en ausencia de los sesquiterpenos. Los datos
mostrados son un promedio de tres experimentos independiente ± SO
De las hojas de Maytenus chiapensis fueron aislados cinco nuevos sesquiterpenos del
mismo esqueleto (Figura 21 ), Jos cuales fueron ensayados igualmente en una línea MOR de L.
tropica sobreexpresada en los transportadores de glicoproteína-P. De esta serie, sólo uno de ellos
(compuesto 4) mostró una actividad muy débil (28% de inhibi~ión del crecimiento a 60 μM)75
•
l 12
Figura 21. Sesquiterpenos aislados de Mayte1111s chiape11sis
Act? /c[k Rf·rn R,'2\q;1<ett2¡¡.
1 R, = R¡ = OAc; R2 = R.,= H
2 R, = OAc; R2 =R.,= H; R¡ =OH
3 R1 = R¡ = OH; R2 = R., = H
4R1 =R2=R3 = R., =0Ac
P,Ac
Ac<? / 9Ac
A'•. .c. ; O) ; ~,.,.DAc
Ac \ ""~Ac
. HO ' 1
OAc
s
Considerando estos sesquiterpenos como "estmcturas privilegiadas'· hemos
realizado un estudio de Estructura-Actividad tipo 3D-QSAR76 de 30 sesquiterpenos (Figura
22) que presentan este esqueleto dihidro-~-agarofurano, 1 O de los cuales fueron aislados de
Mayte1111s c11zcoi11a77 y 20 derivados scmisintéticos, que no han sido descritos en la
lite ratura previamente.
El estudio de actividad se realizó en una línea de crecimiento MDR de l. tropica en
presencia de daunomicina (DNM) usando el ensayo basado en MlT. Su citotoxicidad
intrínseca fue determinada usando la misma concentración de moduladores, tanto en
parási tos sil vestres (WT), como en parásitos MDR en ausencia de daunomic ina. Después de
72 h. de incu bación en presencia de 150 μM de DNM en cantidades crecientes de
sesqu iterpenos, la respuesta de los parásitos MDR fue observada y comparada con parásitos
contro l, creciendo a la misma concentración de DNM. pero en ausencia del modulador. En
es te caso, la quimiosensibilización más eficaz a 150 μM de DNM la exhibieron los
compuestos 2 y 4-87~ (Tabla 15). Todos los derivados químicos (compuestos 11-30). fueron
inactivos o menos activos que sus predecesores.
113
Figura 22. Sesquiterpenos de M cuzcoina ensayados en la quimio-sensibilización de Líneas MDR
de Leishmania. Tropica
O Fu
1 R=Fu 4 R=Bz
2 R=Ac 5 R=Pr
3 R=H 6 R=MeBut
FuO,,ª, A~~ OFu
~ 1 ........., ''
HO OR
11 R=H
12 R=Ac
™ ~ AcQ,, - ª
'% • ,,,, ...
,,
HO OR HO OFu
7 R=Fu 9
8 R=Bz
Ac0,,,§ ~OFAu 4
\ 1 ,, ... , .......
HO OR
13 R=H 18 R=Piv
14 R=Ac 19 R=TFAc
15 R=MeBut 20 R=4-Me0-Bz
16 R=Lau 21 R=4-N02·Bz
17 R=Nap
114
Ac
10
22 R=H 27 R=Piv
23 R=Ac 28 R=TFAc
24 R=MeBul 29 R=4-Me0-Bz
25 R=Lau 30 R=4-N02-Bz
26 R=Nap
L
Tabla 15. Efecto de los sesquiterpenos de Maytenus cuzcoina en el crecimiento de Líneas de l.
tropica WT y MDR.
growth inhibitionª (~)
1511M 711M 3¡1M lμM
compd WT MDR WT MDR WT MDR WT MDR
1 23.4 + 3.1 93.5 ± 1.7 18.1±6.4 86.2 = 0.2 13.8 ± 4.9 52.9 ± 10.1 _b 10.0 ± 9.8
2 15.2 .l 3.5 94.4 ± 1.8 9.7 ± 6.5 90.9 2.1 83.5 .l 9.2 24.5;:. 0.7
3 28.7 :!:: 8.1 9.1:: 6.3
4 35.3 ± 5.8 92.7 ± 5.5 21.4 ± 8.6 93.7::: 1.5 16.5 ± 4.1 74.8 ::!:: 5.9 11.7 = 4.7
5 26.8 ± 2.9 95.8 ± 1.6 20.6 i 2.5 94.8 = 4.5 15.9 ± 5.7 89.1±3.4 30.3 = 2.5
6 31.5 i 6.2 94.7 ± 2.5 24.9 ± 8.0 92.0 = 1.6 21.8 ± 7.7 87.6 ± 3.8 25.7 = 7.5
7 7.2 ± 6.0 94.3 ± 3.0 89.5 = 2.0 79.6 ± 6.8 25.7:::: 7.6
8 15.2 .l 5.6 90.9 ± 5.0 11.0 ± 6.6 89.9:: 5.2 6.9 + 6.9 77.5 ± 5.0 18.0::: 7.1
9 24.6 ± 7.1 89.9 + 4.8 16.4 + 4.9 89.0 = 1.3 14.8 :!:: 2.8 66.9 ± 9.9 20.3 = 5.1
10
11 44.5 ± 2.1 28.5 = 13.4
12
13 10.9 + 7.9
14 50.6 j 9.3 17.1=6.7
15
16 80.5 ± 4.5 29.2 = 10.6 8.8 + 1.3
17 10.6 ± 0.6 95.2 .l 1.3 50.7 ± 8.5 16.5 ± 8.8
18 96.7 ±o.o 82.5 + 5.9 44.5 ± 1.0 18.1 ::!:: 7.4
19 7.1:!::2.7
20 17.2 ± 0.6 98.4 ± 0.7 85.0 ± 3.2 35.4 ±8.6 11.9 ± 6.7
21 59.5 .l 2.8 15.5 ± 3.0
22 8.0 ± 4.6 81.9 ± 3.3 41.1 ± 6.7 11.1=9.1
23 45.0 ± 5.2 14.3 :!:: 7.3
24 28.0 ± 9.2 10.4 ± 6.3
25 9.2 + 4.2
26 8.6 ± 3.5
27 77.6 ± 4.5 25.9 ± 3.5 11.2 :e 4.7
28 36.9 ± 4.6 9.7 J. 2.3
29 11.8 ± 0.7
30 10.8 J. 2.5 51.1±4.1 26.4 + 1.3 13.5 ± 4.4 6.4 :!:: 3.7
- --- - ------ - ----------------
"Parásitos WT y MDR fueron expuestos a 15, 7, 3 y lμM de diferentes sesquiterpenos, en la ausencia o presencia de 150
μM de DNM, respectivamente. Los resultados son expresados como porcentaje de inhibición del crecimiento relativo al
control de crecimiento en la ausencia de sesquiterpenos. Los datos mostrados son el promedio de tres experimentos
independientes± SD. hValores de inhibición del crecimiento entre O y 6% son indicados con una linea para su simplicidad.
Con la finalidad de confinnar la habilidad de los sesquiterpenos para superar la
resistencia a fánnacos, fueron determinados los valores de IC50 para DNM, de la línea
MDR, usando diferentes concentraciones de los sesquiterpenos más activos y selectivos. A
l 5μM (Tabla 16), los compuestos 2, 7 y 8 reducen el índice de resistencia (Relación IC50
entre líneas MOR y WT).
Tabla 16. Efecto de los sesquiterpenos 2, 7, y 8 (aislados en M cuzcoina) en Valores de IC50 en
una Línea de l. tropica.
MDR WT
111.M 15.11M
2 7 8 2 7 8
IC60ª(μMJ 30.0 ± 3.6 33.3 ± 9.8 39.0 ± 6.0 9.0± 1.4 11.0 ± 2.8 20.0 ± 4.2 290 ± 24.8 3.8 ± 0.9
RJh 7.8 8.7 10.2 2.3 2.9 5.2 75.5 1
ºParásitos WT y MOR fueron expuestos a concentraciones incrementadas de DNM en presencia o en la
ausencia de sesquiterpenos a dos concentraciones diferentes (7 y 15 μM). Los resultados son expresados como
la concentración de DNM necesaria para inhibir el crecimiento de los parásitos en un 50%. Los datos
mostrados son el promedio de tres experimentos independientes± SD. "Indice de Resistencia. Relación entre
el IC;ode una Línea MDR y el IC50 de una Línea WT. 'Wo fueron usados los sesquiterpenos.
La resistencia a la DNM en la línea MDR de L. tropica está relacionada con la
disminución intracelular de la acumulación de drogas, principalmente debido a la sobre­expresión
de transportadores Pgp.
115
Afortunadamente, en los últimos 4 años se han registrado en el campo de la
leishmaniasis un total de 22 patentes55
• Nuestro grupo79 ha publicado en el año 2002 el uso
de la trans-chalcona (l,3-difenil-2-propen-1-ona) para preparar un fármaco para el
tratamiento de leishmaniasis visceral, cutánea y mucocutánea, causada por especies de L.
major, L. mexicana, L. braziliensis y L. panamensis. Se encontró que la chalcona posee
potente actividad leishmanicida in vitro, con un valor ICso de 0.32 μg/mL frente a la forma
prosmatigota de L. brazi/iensis.
Este modelo de líneas resistentes de Leishmania sirve de referencia para
estudiar el efecto revertidor de MDR en líneas celulares de cánceres humanos.
Sesquiterpenos de Celastraceas se unen específicamente a la clicoproteína-P humana y
revierten de manera muy eficaz la multirresistencia a fármacos anticancerígenos.
La sobre-expresión de la glicoproteína-P ABCB 1 (MOR), una bomba de flujo
multifármacos, es uno de los mecanismos por el cual las células tumorales pueden
desarrollar multiresistencia a fármacos (MOR), impidiendo así la eficiencia del tratamiento
quimiterapéutico del cáncer. Es por esto, que en el estudio de sesquiterpenos de diversas
plantas de la familia Celastraceae, incluyendo M cuzcoina, M canariensis, M
magellanica y M chubutensis (Figura 23) se analiza la habilidad de los sesquiterpenos tipo
dihidro-J3-agarofurano para revertir el fenotipo MOR dependiente de la glicoproteína-P, y
elucidar su mecanismo de acción molecular64
• El aislamiento, así como la caracterización y
purificación, de estos metabolitos se realiza según lo descrito previamente en la literatura
científica 73
•
76
•
78
•
Figura 23. Estructura de los sesquiterpenos aislados y caracterizados en M. c1ccoina, M.
magellanica, M chubutensis y M. canariensis (OAc, acetato; OBz, benzoato; ONic, nicotinato; OPr,
propionato; OMeBut, metilbutirato; OCin, cinamato; OFu, furoato; OH, grupo hidroxilo; H,
hidrógeno).
Sourcaand c-und R, Ra R, Ro R1 Rt Rr Re
Maytenu• cuzcoln•
Cuzco1 OAc uOBz H OH O Fu H llOFu H
Cuz coz OAc aOFu H OH OFu H llOFu H
Cll&COZ~ OAc aOFu H OH OH H llOFu H In S
Cuzeoz~ OAc aOFu H OH OAc H llOFu H lne
Cuzc:o:J OAc H H OH OFu H poFu H
Cuzco4 OAc aOMoBut H OH OFu H poFu H
Cuzcos OAc aOAc H OH OFu H poFu H
CuacoIn5•. .,_lnd OAc aOAc H OH OH H poFu H
e-•~ OAc aOAc H OH OAc H llOFu H In•
cuzcoe OAc aOPr H OH OFu H jlOFu H
Cuzco7 OAc aOAc H OH OFu H llOFu OAc
CuzcoO OAc aOAc H OH OBz H poez OAc
Cuzc:oll OAc uOH H OH OFu H poFu H
lhytonu• tnO(l.U.nlca
M•llUl1 OBz llOAc ONlc: OH OAc H llOCin H
Mama2 OBz POAc ONlo OH OAc H llOBz H
Matnll3 ONlc IJOAc 0141; OH H poez poez H
M.,,,a4 ONic ___ llOAc OBz OH H llOAc poaz H
Mames oaz llOAc OAc OH H poez poez H
lbmDll OBz llOAc OAc OH H llOAc poez H
M11mo7 OCln llOAc ONlc OH H H llOBz H
Mama10 oaz llOAc H OH H H llOCln H
Mama11 OBz ¡¡0141; H OH H H IJOBz H
Mama12 OAc aONlc H OH OBz H poaz OAc
Ma11U113 OBz c10Nie H H OAc PON; jlOBz H
M•nui14 OBz aOBz H OH OAc POAc poez H
ltl•yr.nu• chullut.n•I•
Machu1 6:--,-~~~~ OH H -~- T!:tT~~x:- - OA&.
Madtu-4 H H oaz
M11ytenua c.narl.,,.I•
C-3 OAc H H OH OAc aOMoBul aOBz OAc
116
La actividad revertidora de la multirresistencia a fármacos in vitro de estos
sesquiterpenos fue estudiada determinando la citotoxicidad de daunomicina y vinblastina
(dos sustratos clásicos de glicoproteína-P) en células NIH-3T3 (células humanas MDR-1
transfectadas) expresado en la glicoproteína (Tabla 17). La relación entre IC5o en ausencia y
presencia de un modulador de glicoproteína-P nos indica el índice revertidor de resistencia,
un parámetro que permite comparaciones cuantitativas entre la eficiencia de diferentes
moduladores de glicoproteína-P. Este índice de reversión de daunomicina y vinblastina con
sesquiterpenos dihidro-~-agarofurano fue determinado a concentraciones incrementadas de
cada fármaco citotóxico y 3 concentraciones fijas del sesquiterpeno (10, 3 y l μmol/L).
Tabla 17. Habilidad Revertidora a la Resistencia a Multifármacos de los Sesquiterpenos, aislados
en M cuzcoina. M canariensis, M magellanica y M chubutensis, sobre células NIH-3T3
transfestadas con la proteína MOR l humana.
Revasal inde.\ witb cllunomycin• Rcmul illda witb vinblullact
Scsqui~cpene 10 ¡¡.M J,.,.. 1,.,.. 10μ.M 3,.,.. 1 ¡al
V~lt 16.11: 2.50 13.4.S: UI 704 =3 .10 18.76 =.S .00 13.18: D.24 6.21=1.10
Cuttol 2.112: 0.70 2.43: O.SS 2.21 : 0.60
Cuua2 10.0l = 0.60 7.80 = 0.70 7.IU::0.22 20.00 = 2.00 S.10:: l.SO 2.ID: O.SO
Cuuol hydrolyud 1.30.:. 0.60 0.86.:. 0.25 0.80.: o.JI
Cuuol oce1ylalcd 2.90: 1.20 l.líO: 0.62 0.90:: 0.12
Cu~ol 11.29 = J.00 7.57:: 2.IU 4.2.l:: 1.10 IS.83:: J.SO 14.86: 2.60 8.98: l.SO
C11tto4 2.90:: o.so 2.10:: 0.40 1.so:: 0 . .$0
CuuoS 21.SO: J.26 16JI :4.08 12.52:: 4.SO 29JO: 8.00 2S.OO: 3.00 10.90: ).22
Cuzco.S hydrolyud 1.00:0.10 0.80 =0. 13 0.80:0JO
CuuoS 1Cd)'laled 1.60: 0.20 1.00 = 0.40 0.80:011
Cuuo6 4.UO:: 1.20 3.40 = 1.00 2.80: 0.70
Cuuo7 18.91.: OJO 11.76: o.. so 7.SI.: 0.24 31JO.: S.20 20.86:: 2.60 14-10 =). 40
Cutto8 4.70 = 1.30 :?.20 = 0.60 :?.DO.:. O.SO
Cutco9 8.76: 1 60 l.66:: o.so 1.8.l:: 0.70 :!0.89:: S.39 S.40: 3.30 2.73:: 1.90
Mamal S.00:: 1.10 .uo:: 1.10 l.1!11-.:0..SO
Manl.11 10.50:: 1 . .30 4.60 = 1.00 2.:10~0.40
Mama.l 10.70:: 3.00 4.911=1.00 2.90:: O.líO
Mmma4 6.00: 1.20 .s..so: 1.10 J.~)! 1.10 20.00: S.00 16.70: J.00 9.20: l.10
MamaS 26.67:: 3.00 24.80:: 4.00 8.7U.:. ).70 125.00: 17.00 117.00 ::!: ?l.40 41.70.:. 7.W
Mam-6 20.80 ! S.00 13.ClO.:. o.so 2.211 !0.40
Mama7 7.10:: 4.80 2.70.:. 0.90 1.60 ! 1.00
MamalO 2.20:: 0.80 1.40:: 0.40 1.10::0.40 57.10:: 9.00 7.40:: 3.00 :?.Sll!!.00
Mamall 4.10 ::!: 1.80 2.00:: 0.10 l.SO ::!: 0.20 22.:!0 :!: 4.00 S.40:: 2.00 3.40 ::!: !70
Mamal? 21.76:: 0.90 l:?.7S:: 0.90 6.IJ: ?.10 87.10 ::!: 14.00 60.60 ::!: 11.00 SS.60 ::!: 7.00
MamaJJ l.30:: 110 1.60: 0.60 1.40 ::!: 0.40
Mam:il4 19.10: 4.00 10.30 ! 2.90 .S.60 :!: 0.80
M..chul 18.l!O ::!: 4.20 16.00 ::!: 5.00 11.40 ::!: 6.30
Mac:hu4 33.SI : 3.20 ll.ll ::!: 2.9.S 11.IO .!: 4.llO 10.l.21=13.00 94.48 :8.00 33.67 .!. 7.90
C·l 1640.: S.20 10.80 :!: 1.10 8 :!O! 1.70 6JJO: 6.00 22.40 !.4.'° IOJ2.:. 4.6'
NOTA: Screening de los sesquiterpenos revertidores de resistencia a la daunomicina y vinblastina, dependiente de la
glicoproteína-P en células NIH-3T3 transfestadas con la proteína MORI humana. El índice de reversión fue definido
como la relación entre el IC50 de células sin sesquiterpenos y el IC50 de células con sesquiterpenos. Los resultados
mostrados fueron obtenidos de series de dos a cualro experimentos, independientes, realizados en triplicado; promedio±
SD (P < 0.05).
*Indice Máximo de Reversión con daunomicina (Relación entre IC50 de células WT y MOR) es de 27.5
t Indice Máximo de Reversión con vinblastina (Relación entre ICso de células WT y MOR) es de 128.3
f Verapamil es un clásico modulador de glicoproteina-P usado para comparación
117
Siete de estos sesquiterpenos (Cuzcos, Cuzco7, mama6, mama12, mamal4, mach~l
y C-3), revierten la resistencia a la daunomicina con eficiencia comparable al verapamtl,
mientras que mamas y machu4 son superiores en potencia. Ensayando un subcon~unto de
sesquiterpenos con vinblastina, fue encontrado el mismo perfil de eficiencia revert.1dora de
resistencia relativa a fármacos, como la descrita previamente. Sin embargo, notona?1ente,
casi todos los sesquiterpenos ensayados mostraron, sustancialmente, mayor índice de
reversión con vinblastina que con daunomicina, y los mas potentes (Machu4, Mamas, Y
Mama 12) revierten la resistencia a la vinblastina a 1 μmol/L, con potencias S a 9 veces
mayores que el verapamil. Lo cual nos indica, que a esta baja concentración, los
sesquiterpenos previamente mencionados, son capaces de disminuir la resistencia a la
vinblastina de células que sobreexpresan MDRI de 128.3
a valores de 2 a 4 veces más pequeños; la resistencia intrínseca de células tipo silvestre
varían su valor de 27.S a valores de 2 a 3 veces más pequeños en el caso de daunomicina.
La toxicidad intrínseca de los sesquiterepenos más potentes, usados a concentraciones
superiores a 1 Oμmol/L en células wild-type NIH-3T3 sensibles, fue generalmente menor
que con el verapamil (43.70 ± 2.80, 14.20 ± 2.20, 26.40 ± 1.30; 18.70 ± I.50, Y 17.95 ±
O.OS% de inhibición de crecimiento a 1 Oμmol/L para verapamil, Cuzcos, Mamas, Mama 12,
y Machu4, respectivamente; P< 0.05).
Los sesquiterpenos de Celastraceas son prometedores moduladores de la
glicoproteína-P humana con potencial aplicación en quimioterapia del cáncer debido a su
eficaz potencia revertidora de multirresistencia y la gran especificidad para glicoproteína-P.
Una reacción dominó se define como un proceso en el que se forman dos o
más enlaces en una sola secuencia (involucrando varias transformaciones), sin aislar
intermedios, cambiar condiciones de reacción o añadir reactivos adicionales81
El número de enlaces formados, la economía de átomos, la complejidad
estructural y funcional introducida en Ja molécula final, la facilidad de manipulación
experimental y las condiciones estequiométricas de los componentes determinarán la
eficiencia de una reacción dominó.
Por otro lado, estas reacciones, por su mecanismo intrínseco, hacen que sean
procesos más respetuosos con el medio ambiente debido fundamentalmente a la
economía de átomos y la reducción de etapas sintéticas, lo que conlleva a una
reducción en la formación de productos secundarios, uso de cantidades menores de
disolventes y empleo de menos reactivos82
Las reacciones dominó son bastante comunes en la naturaleza, aunque la
comparación directa y estricta con las reacciones de laboratorio no es posible debido
a la implicación de multienzimas capaces de catalizar diferentes pasos.
Un ejemplo ilustrativo de reacción dominó es la biosíntesis de los ácidos
grasos a partir de acetato83
• Este proceso está cataiizado por la enzima ácido graso
sintasa que, en animales es una proteína multifuncional que posee todas las
actividades catalíticas requeridas, mientras que las bacterias y plantas utilizan un
conjunto de enzimas.
Las reacciones dominó se clasifican atendiendo al mecanismo del primer
paso1 y así se puede distinguir entre una transformación catiónica, aniónica,
radicalaria, pericíclica, fotoquímica y catalizada por metales de transición. Este
primer paso puede ser combinado con otras reacciones de estos tipos también en un
segundo, tercero e incluso cuarto paso.
118
La combinación de reacciones del mismo mecanismo es conocido como
reacciones horno-dominó, mientras que una secuencia de reacciones con diferentes
mecanismos son reacciones llamadas hetero-dominó.
Tabla 1. Clasificación de las reacciones dominó de acuerdo al mecanismo
de los diferentes pasos.
ter Paso 2° Paso 3er Paso
la catiónico 2a catiónico 3a catiónico
lb aniónico 2b aniónico 3b aniónico
le radicalario 2c radicalario 3c radicalario
Id pericíclico 2d pericíclico 3d pericíclico
le fotoquímico 2e fotoquímico 3e fotoquímico
lf especie carbenoide 2f especie carbenoide 3f especie carbenoide
lg catalizado por metal 2g catalizado por metal
3g catalizado por metal
de transición de transición de transición
lh oxidación-reducción 2h oxidación-reducción 3h oxidación-reducción
Reacciones horno-dominó tales como catiónica-catiónica (la/2a),
aniónica-aniónica (1 b/2b ), radicalaria-radicalaria (1 c/2c), pericíclica-pericíclica
{ld/2d), y reacciones catalizadas por metales de transición se describen en la
bibliografia química frecuentemente. También existe un buen número de
referencias de reacciones hetero-dominó tipo pericíclica-aniónica (1 b/2d) o
aniónica-pericíclica-pericíclica (lb/2d/3d) que han sido investigadas durante
años.
Estamos interesados en la búsqueda de compuestos basados en
estructuras privilegiadas para la prevención y tratamiento del cáncer. En este
sentido hemos trabajado intensivamente en el desarrollo de pequeñas
quimiotecas a partir de productos naturales tales como lapachol, pristimerina y
tingenona que han mostrado excelentes propiedades anticancerígenas87
•
88
•
92
•
90
Como objetivo concreto en el presente trabajo nos hemos propuesto la
preparación de sistemas bis-piranobenzoquinona mediante reacciones dominó
tipo aniónica-pericíclica basadas en dos reacciones bien conocidas como son la
condensación de Knoevenagel y una reacción de hetero Diels-Alder con
demanda inversa de electrones.
Este tipo de sistemas pensamos que pueden ser potencialmente bioactivo
debido a las características estructurales que presentan.
En este sentido, moléculas con estructura quinónica constituyen una de
las clases más importantes de compuestos en química orgánica por las
interesantes bioactividades que presentan86
• Entre las actividades descritas
d estacan 1a s qum. onas como ant1. cancen,g enas 87 , ant1• ma la' n.c as 88 · ba cter1.c 1' d as 89 •
herbicidas90
, fungicidas91 y reguladoras del crecimiento92
•
119
Esta diversidad de bioactividades se relaciona con la distribución de
densidad electrónica que presentan, con la habilidad de las quinonas para aceptar
uno y/o dos electrones formando el anión radical o el dianión correspondiente y
también por sus propiedades ácido-base93
•
Enzimas
Quinona
Radical semiquinona
El
H202 •-- - - - -· [ "0-c:f' ] Anión radical su peróxido
agrupamiento 1 ,4-benzoquinona se encuentra presente en muchos productos
naturales y compuestos de interés farmacológico y puede ser considerado como
una estructura o subestructura privilegiada en química médica, según la
definición dada por Evans a aquellas entidades químicas que se unen de manera
eficiente a múltiples receptores94
· Algunos ejemplos representativos85 son
isoasterriquinona y geldanamicina que son potentes inhibidores de tirosina
kinasa e irisquinona que es un quimiosensibilizador.
o
o
El irisquinona
R=OCH3,geldanamicina
R=NHCH2CH=CH2, 17·
(alilami no)-17 -demetoxi
geldanamicina
agrupamiento benzopirano se encuentra también presente en una gran variedad
de productos naturales y sintéticos con potenciales actividades. El estudio de
amplias quimiotecas de productos que incluye benzopiranos ha sido abordado
por el profesor Nicolaou, ratificando la consideración de estructura privilegiada
para dicha estructura 95
•
96
•
97
120
El agrupamiento pirano-1 ,4-benzoquinona es un agrupamiento poco
frecuente en la naturaleza existiendo unos pocos ejemplos tales como betulinan
B aislado junto con betulinan A de los esporóforos del hongo Lenzites betu/ina98
•
El producto
b etu 11. n an B betulinan A betulinan B posee una
potente inhibición de la peroxidación de lípidos con una concentración mínima
inhibitoria de 2.8 ¡1g/mL y siendo un excelente atrapador de radicales. El daño
peroxidativo de las células y orgánulos de membranas por radicales libres ha
estado implicado en la patogénesis de enfermedades tales como ateroesclerosis,
artritis, isquemia de miocardio y cáncer. El producto betulinan A resultó ser un
compuesto cuatro veces más activo que la Vitamina E como atrapador de
radicales99
•
A continuación se muestran las estructuras de otros productos naturales
descritos en la bibliogr~fia que poseen un esqueleto de piranobenzoquinona, bis­piranobenzoquinona
y piranofuranobenzoquinona.
El compuesto metilanhidrovilangina100 se aisló de las frutas de Myrsine
africana y Maesa Lanceolada.
De los esporóforos de Hydnellum fern1gi11eum y H. zonztum de aislaron
los pigmentos hydnuferrugina e hydnuferruginina cuyo esqueleto básico es una
piranobenzoquinona '°1
•
Con los datos expuestos anteriormente, que vinculan al agrupamiento 1,4-
benzoquinónico y el benzopirano con estructuras privilegiadas y el hecho de que
existan pocos metabolitos que presenten la unidad pirano-quinona, y a los que se
les ha determinado su bioactividad, han mostrado ser potencialmente bioactivos,
pensamos que la preparación de estructuras tipo bis-pirano-l ,4-benzoquinona
podría ser un buen acceso a moléculas bioactivas de interés.
Como objetivos concretos nos hemos planteado:
A) La síntesis de sistemas bis-piranobenzoquinona mediante
reacciones dominó tipo Knoevenagel-hetero Diels-Alder a partir de 2,5-
dihidroxibenzoquinona, formaldehído y alquenos ricos en electrones.
8) Optimización de las condiciones de reacción, tomando como
reacción patrón la reacción de 2,5-dihidroxibenzoquinona, paraformaldehído y
etil vinil éter.
C) Introducir complejidad y diversidad estructural en los
sistemas bis-piranobenzoquinonas mediante el uso de dienófilos
cíclicos.
D) Explorar la versión "'dos componentes" de dicha reacción
mediante el uso de aldehídos que incluyen en su estructura un doble enlace.
121
E)
sintetizados.
Evaluación de la actividad biológica de los productos
Sólo existe en la bibliografia química un ejemplo de síntesis de sistemas
bis-piranobenzoquinona y es el publicado por Nicolaides y colaboradoresw2
•
Ellos utilizan una aproximación biomimética basada en una doble alilación de
2,5-dihidroxibenzoquinona y posterior ciclación intramolecular en medio ácido,
obteniendo bajos rendimientos en el producto deseado 16, que es aislado junto
con el aducto 18 (Figura 1 O).
Figura 33: Síntesis de derivados de bis-piranobenzoquinona:
o -®- º 16
45%
/ OH~
[~º --~] : o \H20 -oC7 I u ~
-~-Q
18
16%
17
Reactivos y condiciones:
(i) LiH, DMSO seco, -78 ºC.
(ii) Lil, 4-bromo-2-melll-2-buteno.
(iil) H2S04 conc, 25 ºC.
(iv) H20.
(v) Oxidación por contacto con el aire.
Cuando se trata 2,5-dihidroxi- l ,4-benzoquinona con hidruro de litio,
ioduro de litio, en DMSO seco, y dos equivalentes de 4-bromo-2-metilbut-2-eno
·se obtiene el producto 2,5-dihidroxi-3,6-bis(3-metilbut-2-enil)-1,4-benzoquinona
15 con un 30% de rendimiento. Cuando este compuesto fue tratado con ácido
sulfúrico concentrado se obtuvieron los aductos 2,2,7,7-tetrametil-3,4,8,9-
tetrahidropirano[2,3-g]cromen-5(2H), 10(7 H)-diona 16 y 2,2,9-trimetil-3,4-
dihidro-2H-benzo[h]cromen-5,6-diona 18 con un rendimiento de 45 y 16%
respectivamente. La esperada o-quinona 17 no se formó en el medio de reacción.
122
La síntesis de sistemas bis-piranobenzoquinonas, tal y como se ha
mencionado en la introducción, se pretende abordar mediante una reacción
dominó tipo Knoevenagel hetero Diels-Alder.
Existen antecedentes en la bibliografía química de llevar a cabo este
mismo tipo de reacción con compuestos 1,3-dicarbonílicos tipo ácido N,N­dimetilbarbitúrico.
ácido de Meldrum 0 dimedona1oJ,t04,tos,10ó,107.
ácido N,N-dimetilbarbitúrico
º"YYº
ºXº
áci~o de Meldrum dimedona
En nuestra aproximación nos proponemos usar el compuesto simétrico
2,5-dihidroxibenzoquinona como adecuado equivalente sintético de compuestos
1,3-dicarbonílico, no existiendo ningún tipo de antecedente bibliográfico previo
del uso de este reactivo en este tipo de reacción.
Nuestra estrategia sintética se basa en atrapar el intermedio, resultante de
la condensación de 2,5-dihidroxibenzoquinona y paraformaldehído, u otros
aldehídos, con dienófilos ricos en electrones, mediante un proceso dominó
multicomponente.
La formación de los dos anillos piránicos se lleva a cabo mediante una
reacción hetero Diels-Alder con demanda inversa de electrones donde la
interacción dominante será la LUM01-1eterodieno-HOMOoienófilo·
a
n
qO OH
(CH20)n
HO
o [*] Intermedio
atizamos el intermedio de reaccmn son posibles tres sistemas de dienos
susceptibles de ser atrapados por los correspondientes dienófilos.
123
[*] X O
a) X~+ .!__~x
X O
o
X
{~] X b) ~ + ÍI ____.. ~
X 1
O X
o
) ·[~]+"X- ol
e) M ~o
Energéticamente la posibilidad c) es claramente desfavorable frente a la
a) y la b)rn8
•
109
•
11 º·111 como se analizará más adelante.
En el caso a) los sistemas heterodiénicos no se encuentran en posiciones
contiguas y dará lugar a la formación de bispirano-1,4-benzoquinonas lineales,
mientras que en el caso b) los dos sistemas se encuentran en disposiciones
contiguas y las correspondientes cicloadiciones darán lugar a bispirano-1,2-
benzoquinonas angulares.
En nuestro caso las reacciones fueron regioselectivas puesto que sólo
encontramos productos lineales. Los datos espectroscópicos de los productos
obtenidos están de acuerdo para un patrón de para-quinonas en lugar de orto­quinonas1
12•91.
Los productos fueron obtenidos como una mezcla 1: 1 de diastereómeros
con distinto Rr e idénticos espectros de 1H RMN y 13C RMN. Cuando partimos
de dienófiloos aquirales, uno de estos diastereómeros posee un centro de simetría
mientras que el otro es quiral y pertenece al grupo puntual de simetría C2,
mientras que con dienófilos quirales no se cumple esta regla.
Estos
~OyR
R''.~oA.(V
o
diastereómero meso
con un centro de simetria
R
(±)
dlastereómero qulral
con eje de simetria C2
diastereómeros son el resultado de las diferentes aproximaciones en el proceso
de cicloadición 113
•
114
•
115
•116·117del intermedio con el doble enlace del dienófilo y
que pueden ser endolendo, exolexo, endolexo y exolendo.
124
Las aproximaciones endolexo y exolendo llevan a la formación de
moléculas idénticas y que resultan ser el diastereómero aquiral.
Las
aproximaciones
exo/exo llevan a
dos moléculas
enantiómeras
presentan
H
Endo H~R
Exo #o
R»HH
+
R
R$0 1 1
O R
o 40
R
H~H #o Exo
R».H En do
H t H
R
'''R
o
R,"(O~
~O...J.,,R
o
Enantiómeros
endolendo y
la forma de
que
simetría C2•
Nos llamó la atención que los diastereómeros obtenidos con distinto
comportamiento cromatográfico, presentaran idénticos datos de 1H RMN y 13C
RMN.
Encontramos casos en la bibliografia química de aductos diastereómeros
con espectros coincidentes de 1H RMN y 13C RMN. Recientemente, el grupo de
investigación del Profesor Xiao-Zhang Zhu, ha publicado un artículo sobre la
síntesis de sistemas con estructura ipticeno quinona118
·
Estos sistemas son sintetizados mediante una reacción de hetera Diels­Alder
entre p-benzoquinona y antraceno con sustituyentes metoxilo (Figura 11 ).
Debido a la simetría de los reactivos se han obtenido como productos dos
diastereómeros con idénticos espectros de 1H RMN y 13C RMN.
125
Figura 34: Síntesis de
ro$º· ó OMe O
1,4-dímetoxiantraceno
-
O Me
derivados
CAN
de ipticenoquinonas:
1,4-dimetoxi
antraceno
P-cloroanilo
diastereómeros con identicos
espectros de 1 RMNy 13c RMN
Como primer objetivo nos propusimos la búsqueda de las condiciones más
adecuadas para llevar a cabo la reacción dominó Knoevenagel hetero Diels-Alder
(DKHDA) tipo aniónica-pericíclica y para ello seleccionamos como reacción
patrón la reacción de 2,5-dihidroxiquinona con paraformaldehído y vinil etil éter
bajo diferentes condiciones.
[#] Intermedio
La Tabla 2 ilustra los rendimientos obtenidos pudiéndose apreciar que
sólo se obtienen rendimientos aceptables cuando se utilizan excesos de
paraformaldehído y etil vinil éter.
126
Tabla 2: Diferentes condiciones de reacción para optimizar la
reacción de 2,5-dihidroxiquinona (1) con etil vinil eter.
Entrada
1/ (CH20)n/
Disolvente Condiciones
Rendimiento
CH2CHOEt %
1 1116/9 dioxano reflujo 1 OOºC, 24h. 28
2 1116/9 dioxano tubo cerrado, ttOºC, 8h. 50
3 1116/9 dioxano tubo cerrado, l IOºC, 24b. 88
4ª 1116/9 dioxano tubo cerrado, llOºC, 24b. 32
5ª 1132/9 dioxano tubo cerrado, l IOºC, 15b. 47
6ª NO 1/16/9 CH3CN tubo cerrado, llOºC, 24h.
REACCIONA
7b NO 1/8/9 dioxano reflujo 1 OOºC, 24b.
REACCIONA
"en lugar de parafonnaldehído se usó fonnalina (solución acuosa de fonnaldehído al
36.5% en peso).
b uso de TAMA (Trifluoroacetato de N-metilanilina) y 1,3,5-trioxano como
equivalente sintético de formaldehído.
Los mejores resultados se consiguieron con la siguiente proporción de
reactivos 2,5-dihidroxibenzoquinona/(CH20)n/etil vinil éter ( l /16/9). Cuando la
reacción se llevó a cabo con dioxano bajo reflujo, el rendimiento obtenido fue de
un 28%, este rendimiento se consiguió mejorar usando un tubo cerrado a 110°. El
uso de fonnalina en lugar de paraformaldehído dio rendimientos inferiores.
También usamos T AMA 119 (Trifluoroacetato de N-metilanilina) y 1, 3,5-
trioxano como un equivalente de condensación aldólica de fonnaldehído sin
buenos resultados.
Dado que el proceso requiere lar~os tiempos de reacción decidimos
utilizar irradiación con microondas120·121·12- para ver si, éstos, se disminuían y
conseguíamos aumentar los rendimientos. Usamos varios disolventes
encontrando que efectivamente se acortaban los tiempos de reacción. Los
resultados obtenidos se representan en la Tabla 3. Todas las reacciones se
realizaron en un tubo cerrado.
Tabla 3: Resultados obtenidos en la reacción de 2,5-dihidroxiquinona
y etil vinil eter usando radiación con microondas.
Entrada 1/ Disolvente Condicionesc Rendimiento
{CH20~n/CH2CHOEt %
1 1/16/9 dioxano MW,45 min 37
2 1/16/9 dioxano MW,45 mio 15
3 1116/9 tolueno MW,45 min 54
4 1/16/9 p-xileno MW,45 min
NO
REACCIONA
5 1/16/9 1,2-dicloroetano MW,45 min 78
6 11819 1,2-dicloroetano MW,45 min 29
7 1/16/9 1,2-dicloroetano MW, 20 min 88
e irradiación a 630 W con un microondas doméstico.
127
Se probaron distintos disolventes atendiendo a sus características frente a
la irradiación con microondas. Esencialmente, la capacidad de un disolvente para
calentarse con microondas depende de sus propiedades dieléctricas (e') y de la
eficiencia con que la energía absorbida puede ser convertida en calor, descrita
por el factor de pérdida dieléctrica (e"). Para comparar la capacidad que tienen
distintas sustancias de transformar energía de microondas en calor, a una
frecuencia y temperatura determinada, se utiliza el factor de disipación tang 8,
que se define como la tangente de la relación del factor de pérdida dieléctrica y
la constante dieléctrica (tang e"/t'). Los valores del factor de disipación están
recogidos en tablas y están comprendidos entre O y 1. Probamos desde
disolventes transparentes al microondas como el dioxano hasta aquellos con
adecuados valores de factor de disipación 8, como el 1 ,2-dicloroetano (tang
8=0.44). Utilizando este mismo disolvente se intentó ver si se podría variar la
proporción de reactivos, pero no se consiguieron buenos rendimientos.
La proporción de diastereómeros 1 : 1 obtenidos en cada reacción fue
ratificada por HPLC y no se observó variación de esta proporción al pasar de
calentamiento convencional a irradiación con microondas.
Como consecuencia de los elementos de simetría presentes en los
aductos, éstos muestran una gran simplicidad en sus espectros de 1 H RMN y 13C
RMN, observándose la mitad de las señales de protón y de carbono. A modo de
ejemplo representativo, en la Figura 12 se muestran los espectros de 1 H RMN y
1 C RMN de los aductos obtenidos en la reacción de 2,5-dihidroxibenzoquinona
con paraformaldehído y etil vinil éter.
Biotecnología e Ingeniería Genética de Rutas Metabólicas.
Los metabolitos secundarios juegan una variedad de funciones tales como
atrayentes de polinizadores, y moléculas de defensa contra el ataque de animales y
microorganismos, los cuales permiten la supervivencia de estos seres vivos en su
ecosistema. Estas sustancias también tienen una gran importancia para el hombre. Sin
embargo, a pesar de los grandes esfuerzos realizados por la industria química para
lograr su síntesis, se han conseguido escasos éxitos, y así las plantas aún constituyen la
mayor fuente de obtención de vitales compuestos medicinales.
A finales de los años 70, el cultivo de células vegetales se vio como una
alternativa o vía adicional para la producción de estos metabolitos. No obstante, con
cierta frecuencia las bajas cantidades obtenidas en estos cultivos, a menudo inferiores a
las cantidades presentes en la planta, son un obstáculo para su explotación comercial.
Sin embargo, algunos proyectos fueron exitosos y comercialmente explotados tales
como la producción de shikonina, berberina, paclitaxel mediante el cultivo de células de
Lithospermum erythrorhizon, Coptis japonica y Taxus brevifolia respectivamente.
Por otro lado, se han intentado diferentes estrategias para tratar de incrementar la
producción de metabolitos secundarios en cultivo, éstas incluyen por ejemplo la
manipulación del medio nutritivo, inducción de cultivos morfológicamente
diferenciados que se conoce presentan mayor potencial bioquímico. Así el
establecimiento y empleo de cultivos de raíces en cabellera tras la infección con
Agrobacterium rhizogenes mostró un incremento en Ja producción de aquellos
metabolitos secundarios que naturalmente se sintetizan y acumulan en las raíces de la
planta, obteniendo la producción de cantidades igual o incluso superiores a las obtenidas
en Ja raíces de la planta. Además, en los últimos 10-15 años, avances en biotecnología
128
de plantas han permitido el éxito de la transformación genética de plantas, dirigidas
principalmente a la mejora de características agrícolas. En los últimos años, y con los
rápidos avances conseguidos en el campo de la tecnología del ADN recombinante, se ha
logrado la elucidación, aislamiento Y clonaje de genes responsables de la codificación
de enzimas que participan en diversas rutas metabólicas, identificándose además
muchos procesos metabólicos hasta ahora poco conocidos. Así, se ha comenzado a
abordar la manipulación genética de plantas medicinales, principalmente para conseguir
un incremento en la producción de diversas sustancias bioactivas, consiguiéndose
atractivos resultados de manipulaciones genéticas dirigidas a Ja alteración y control del
metabolismo secundario. Asimismo, se ha hecho posible confeccionar el metabolismo
secundario de determinadas rutas de plantas medicinales y obtener mayores
rendimientos en la producción de un producto diana, y al mismo tiempo también aplicar
luz y conocimiento sobre el control de los complejos procesos metabólicos.
En nuestro laboratorio, se ha abordado la biotecnología de las especies Atropa
baetica, Maytenus canariensis, M amazonica, _Echium acanthocarpus, E. aculeatum, E.
callythirsum y E. virescens.
Con todas estas especies, se ha conseguido o se aborda el establecimiento de
cultivos de raíces en cabellera tras el empleo de la bacteria Agrobacterium rhizogenes,
además del intento por conseguir la sobreexpresión de genes codificadores de enzimas
dianas, para sobreexpresar su síntesis y así conseguir una mayor acumulación de
determinados metabolitos bioactivos.
Atropa baetica sintetiza alcaloides tropánicos, siendo el mayoritario atropina
seguido de escopolamina, pasos metabólicos catalizados por la enzima H6H. La
sobreexpresión del gen h6h resultó en una alteración del metabolismo, consiguiéndose
una mayor acumulación de escopolamina en detrimento de atropina en los cultivos de
raíces en cabellera transgénicos establecidos. Asimismo, se ha conseguido la producción
de enzima recombinante h6h en Escherichia coli, y se pretende emplear esta enzima en
síntesis orgánica, empleando esta enzima recombinante como catalizador orgánico, para
la obtención de productos enantioméricamente puros que pueden presentar cierta
bioactividad.
Figura 35.- Esquema de la doble reacción catalizada par la enzima H6H (hiosciamina
6~hidroxilasa)
Me
1
N
~ H~H,OH
Yú (-)-hiosciamina
H6H
Me
1
OH J~
~~ H~H20H
~
H6H
6¡3-hidroxihiosciamina
129
Me
1
N 4 H~H,OH
°lfo escopolamina
La especie M canariensis presenta sesquiterpenos agrofuránicos, con distintas
actividades biológicas (antitumoral, revertidor de MOR o disuasoria de la
alimentación), metabolitos que aparecen principalmente en la corteza de raíz. Con esta
especie se ha llevado a cabo su multiplicación in vitro y el establecimiento de
protocolos· para su propagación, que serán aplicados en futuras modificaciones
genéticas. Además, se han inducido cultivos de raíces en cabellera como sistema
biológico para investigar la síntesis y acumulación de estos metabolitos, y contemplar
una posible modificación genética de esta ruta metabólica. Se siguen los esfuerzos por
conseguir similares resultados con M amazonica.
Figura 36.- Estructuras moleculares de diferentes sesquiterpenos agarofuránicos de
Maytenus canariensis
Sesquiterpeno agarofuránico
R4
~1 / ~5
Las especies endémicas canarias
del género Echium son atractivas pues
acumulan interesantes ácidos grasos
omega-3, de elevado interés en nutrición
humana, por sus propiedades medicinales y
por su interés en nutrición en acuicultura.
Éstas acumulan interesantes niveles
de los ácidos gammalinolénico (GLA) y estearidónico (SDA), constituyendo la
principal fuente natural vegetal de éstos ácidos. Se han inducido dos sistemas de
cultivos de raíces en cabellera de las especies E. aculeatum y E. virescens, y su
establecimiento está resultando dificultoso pues no terminan por crecer en los distintos
medios nutritivos diseñados. Con estas especies se llevará a cabo el clonaje y la
sobreexpresión del gen Ll6-desaturasa, que interviene en la desaturación del ác. linoleico
en GLA y del ác. a-linolénico en SDA, de tal forma que la producción de éstos
demandados ácidos grasos resulte sobrestimulada.
Figura 37.- Metabolismo de los ácidos grasos omega-3 y 6 derivados de ác. Grasos
esenciales y enzimas (elongasas y desaturasas) que participan en la ruta .
.1i.•-dcrscrturasa ,ll.:U:-cfcrsatal"GSO OMEGA 6 .flU-dcrsaturcuia
Ác. - Ac. eldce - Ác.Unolcdc.,
asteárico /" LA
130
P,..cous.-OA.....,.
pr&lcipa!mento a plantas
Química Maci-o y S uprnmolecular
Nuestra área de trabajo se divide en dos subáreas, una dedicada a la síntesis Y
desarrollo de metodología sintética orientada a la obtención de compuestos de alto valor
añad ido. y otra dirigida al diseño de nuevas estructuras macro y supramoleculares con
aplicaciones que van desde la ciencia de materiales a la medicina pasando por la síntesis
orgánica, la catálisis, la biología molecular el transporte y suminsitro de fármacos, etc.
Dentro de la primera esta rnos trabajando en la síntesis de un nuevo neo­clerodano,
la (+) Tcubrcvina G. Los clcrodanos son una familia de diterpenos que
presentan interesantes propiedades biológicas de las que cnbe des\acar \a u Ü\'\c.\u \
antiinllamatori a. La novedosa estructura y funcionalidad que presenta es\e neo­clcrodano
lo hace un inte resante obj etivo s intético. Este proyecto se desarrolla en
colaboración con el Profesor Andreas Gansiiuer de Ja Universidad de Bonn que aporra
su extensa experiencia en la síntesis estcreoselectiva contro lada por los reactivos.
En el área de la química macro y supramolecular nuestro interés está centrado en
la síntesis de nuevas estructuras dendríticas para su aplicación en varios campos que van
desde la catális is química al transporte y suministro de fármacos. pasando por la
potencial aplicación en ciencias de materiales y aplicaciones biomédicas. Estas
estructuras están basadas en anillos de oxazolidina, figura * y su síntesis se desarrollaª
través de una metodo logía versátil, que permite la manipulación racional de las
potenc1· alcs nuevas propie-dades de la macromole. cula. de manera que tanto el nu· c.¡ e o, e. l
espacio interior y la periferia de ella puede ser diseñada a deseo. (Por ejemplo la smte:_is
de un dendrímero de tamaño medio que posea un interior hidrofóbico, de tamano
de fi nido, y una periferia hidrofílica de manera que pueda actuar como modelo
cnzimút ico o bien como transportador y suministrador de fármacos. Si quieres puedes
int roducir este ej emplo. Como lo consideres.
Figura 38 ~ j
~-.
131
Ya dentro de la qmm1ca supramolecular otros dos aspectos que estamos
estudiando es el de la obtención de nuevos organogeladores con propiedades
predefinidas, por un lado, y por otro el diseño y síntesis de nuevos lazos moleculares y
la determinación del efecto molde en el mecanismo de formación de los mismos. El
interés de estas moléculas radica, entre otros, en el hecho de poseer dimensiones de
nanoescala.
Los geles son compuestos que se encuentra de manera habitual en nuestra vida
diaria pero que en los últimos diez años han experimentado un notable desarrollo como
materiales únicos con múltiples aplicaciones que van desde la cosmética a la ciencia de
materiales y aplicaciones en farmacología. Nuestro organogelador está basado en
poliamidas
o , ... ~-.,
º >~'R '(((~z º
yv Vi1 ~~
--==
fj "l -
NH2 H2N
Figura 39
La obtención de moléculas de tamaño nano es de importancia crucial a la hora
del desarrollo y diseño de nuevos dispositivos útiles tanto en electrónica, fotónica como
en medicina. Los lazos moleculares se conocen de su existencia y funcionalidad en la
naturaleza. Los lazos moleculares en los que estamos estudiando el mecanismo de su
formación están basados en los desarrollados por el Prof. Vogtle,
132
Figu ra 40
b)
e~ 18
17 111 111
Fig *
Los diseñados están basado en el uso de bloques estructurales distintos a las
unidades de piridina así como los que incorporan una funcionalidad en posición 4 de las
unidades de ciclohexanos. La importancia en la determinación del mecanismo de
formación está en la posibilidad de introducir asime tría en la topología del lazo, ya de
por sí poseer elemento de quiralidad topológica.
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