Laurencia microcladia (Ceremiales, Rhodomelaceae) en Canarias: II. Estudio preliminar químico

              Rev. Acad. Canar. Ciena, XXII (Num. 3), 37-51 (2010) (publicado en octubre de 2011)
LAURENCIAMICROCLADIA (CERAMIALES, RHODOMELACEAE)
EN CANARIAS. II. ESTUDIO PRELIMINAR QUIMICO.
E. Aylagas1
, M.a L. Souto2
, M. Machin-Sanchez & M. C. Gil-Rodriguez1
1 Departamento de Biologia Vegetal (Botanica). Universidad de La Laguna
38071 La Laguna, Tenerife, Islas Canarias. evabiologia@gmail.com
2 Institute Universitario de Bio-Organica "Antonio Gonzalez". Universidad de La Laguna
Astrofisico Francisco Sanchez 2. 38206 La Laguna, Tenerife, Islas Canarias
RESUMEN
En este trabajo se aborda el estudio quimico preliminar del alga roja recolectada en
la isla de Fuerteventura, Laurencia microcladia. El metabolito mayoritario aislado de esta
rodofita corresponde a una sustancia halogenada con esqueleto carbonado C 15 no terpenico.
El compuesto se trata de una acetogenina conocida E- dihidrorhodofitin. Dicho compuesto
no mostro actividad antiproliferativa significativa frente a las lineas celulares de tumores
solidos ensayados.
Palabras clave: Acetogeninas, productos nturales, Canarias, Laurencia microcladia,
Rhodophyta.
ABSTRACT
In this paper, we report a chemical preliminary study of the red seaweed Laurencia
microcladia colected in Fuerteventura Island. The main secondary metabolite isolated was a
previously reported halogenated substance possessing a non terpenoid C 15 , skeleton, E-dihidrorhodophytin.
This compound was evaluated against five human solid tumor cell lines
and was essentially inactive.
Key words: Acetogenins, natural products, Canary Islands, Laurencia microcladia,
Rhodophyta.
1. INTRODUCCION
Los productos naturales estan considerados una importante fuente de sustancias bio-logicamente
activas que son aplicadas en diferentes terapias y/o tratamientos. Se les consi-dera
naturales por su aislamiento a partir de organismos vivos, bien terrestres o marinos, y
pueden emplearse directamente como drogas o servir de modelos para sintetizar compues-tos,
asi como para modificar sus estructuras y generar analogos que las optimicen [13].
En las ultimas decadas, gran parte de la investigacion ha sido dedicada a los recursos
marinos, donde el 1,8 % de sus extractos han mostrado actividad en ensayos in vitro, frente
al 0,4 % en los terrestres. Esta mayor diversidad tiene sentido si se entiende el caracter his-
37
torico del medio marino y la presion selectiva que este ejerce sobre los organismos que lo
habitan [10]. Todo esto ha dado lugar a que las especies adaptadas a este ecosistema hayan
desarrollado numerosos y diversos mecanismos bioquimicos y fisiologicos que incluyan la
produccion de compuestos bioactivos para completar funciones tan importantes como la
reproduction, comunicacion, o protection contra otros depredadores, entre otras.
Asi, entre los organismos empleados por los investigadores para el aislamiento y elu-cidation
de nuevos productos, las algas han demostrado poseer gran cantidad de metaboli-tos
halogenados con importante actividad biologica. Particularmente, las algas de la division
Rhodophyta, las cuales han dado lugar, hasta la fecha, a mas de 1.500 compuestos publica-dos.
Mas de la mitad de estas citas (75%) han tenido lugar en la familia Rhodomelaceae,
donde el 85% han sido aislados del genero Laurencia Lamoroux [2] y, en el cual, la mayo-ria
de los compuestos contenian halogenos [4] [6], principalmente terpenoides, acetogeninas
y aromaticos, aunque tambien son citados como fuentes de derivados de acido eicosanoico
[7]. La elevada produccion quimica por parte de estas especies, hace que sea, probablemen-te,
el genero mas estudiado y quimicamente mas complejo [15].
Las especies del genero Laurencia se caracterizan por ser productoras de numerosos
metabolitos secundarios con diferentes propiedades biologicas [3], entre las que se incluyen
antimicrobianas, antitumorales, inmunosupresoras, anticolesterolemicas, pesticidas, etc. [5].
La produccion de dichos metabolitos en las algas se ha relacionado con la capacidad de
almacenaje en estructuras especializadas, unas vesiculas refractantes ubicadas generalmente
en la capa de celulas mas superficial, a las que se les ha denominado corps en cerise o cuer-pos
de cereza [16]. Las especies de este genero se encuentran ampliamente distribuidas en
mares tropicales, subtropicales y templados [8] [12] y estan representadas en las islas
Canarias, donde L. microcladia Kutzing ha sido citada para las islas de El Hierro, La Palma,
Tenerife, Gran Canaria, Fuerteventura y Lanzarote [9].
Por otra parte, la identificacion de las especies se ve dificultada por el solapamiento
de caracteristicas morfologicas y una gran flexibilidad fenotipica. Como resultado de ello, se
ha generado confusion y controversia en lo que a su clasificacion, identificacion, sinonimia
y nomenclatura se refiere [17]. Asi, los estudios moleculares y las aproximaciones quimio-taxonomicas
se estan empleando como herramientas complementarias a los estudios morfo-logicos
con el fin de esclarecer la identidad de cada taxon.
El objetivo de este trabajo es el estudio quimico preliminar de la especie Laurencia
microcladia, recolectada en el archipielago Canario. Se centra en el aislamiento y elucida-tion
de metabolitos secundarios halogenados, a los que posteriormente se les somete a eva-luation
de su actividad biologica frente a lineas celulares tumorales.
2. MATERIALES Y METODOS
Recoleccion y estudio preliminar de las muestras
Laurencia microcladia se recolecto en la localidad de El Cotillo, isla de Fuerteventura
durante el mes de Julio de 2009. La recoleccion se llevo a cabo en los primeros metros del
sublitoral haciendo uso de equipo de buceo ligero y redes que permitian ir almacenando el
material in situ. Una vez realizada la colecta, el material, de 2.032 g de peso humedo, se
guardo en bolsas de plastico refrigeradas hasta su traslado al laboratorio. Una muestra de este
material fue depositado en el Herbario de la Universidad de La Laguna, Departamento de
Biologia Vegetal, Botanica, bajo la referenda TFC Phyc 14446.
38
EXTRACCION Y AISLAMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS
La muestra humeda, una vez en el laboratories se extrajo por maceracion a tempera-tura
ambiente, en una mezcla de CHCl3:MeOH (1:1) (3x) durante cinco dias. El disolvente
rue evaporado obteniendose un extracto organico de aspecto aceitoso y color verdoso de 14
g, al cual se le denomino LM-1.
Los restos de material vegetal que quedaron tras la maceracion se dejaron secar a tem-peratura
ambiente, se trituraron y posteriormente, se sometieron a una segunda extraccion en
Soxhlet, usando como disolvente CH2C12 , hasta agotamiento. Se obtuvo finalmente un
extracto de 1.1 g al que se le denomino LM-2 y se almaceno en la nevera, para posibles estu-dios
posteriores.
Marcha cromatografica del extracto LM-1.
El extracto resultante de la maceracion del alga, LM- 1 , rue sometido a cromatografia
de exclusion molecular en una columna de Sephadex LH-20 usando como eluyente una mez-cla
de MeOH:CHCl3 (1:1) (Fig. 1). El extracto se anade en la columna en dos pinchazos de,
aproximadamente, 6 g cada uno. Una vez comienza la marcha cromatografica se recogen
Muestra initial
2 Kg
LM-2
LMrl
LM,.4(Frl)
0.059 g
LM14
(Fr2)
LMr2
LM-1
14 g
LMr3
Sephadex LH-20
MeOH:CHCl3 1:1
rzr~
LMr4
4.78 g
LMr5
(Fr3)
LM14
(Fr4)
LM14
(Fr5)
LM14
(Fr6)
LM,_4
(Fr7)
LM,_4
(Fr8)
HPLC
«-Hex:AcOEt 95:5
LM
(Frl)A
LM
(Frl)B
LM-E,
LM
(Frl)C
LM
(Frl)D
LM-E^
LM
(Frl)E
0.018 g
LM
(Frl)F
HPLC
«-Hex:AcOEt 95:5
LM-E, LM-E4
1.9 mg V ° J
LM
(Frl)G
LM-E<
Figura 1.- Marcha cromatografica del extracto LM-1.
39
fracciones de 12 ml en una gradilla de 50 tubos. Cuando se recogen todos los tubos, de
ambos pinchazos, se lava la columna con MeOH, recogiendo tambien ese volumen, para no
perder posibles metabolitos presentes en la fraccion del lavado. Finalmente, las fracciones se
reunieron de acuerdo al comportamiento observado en capa fma (TLC), dando lugar a: LMr
1, LMr2, LMr3, LMr4 y LMr5, las cuales se analizaron por RMN 'H.
Los datos espectroscopicos obtenidos, nos hicieron decidir continuar con la fraccion
LMr4, sometiendo, en cuatro porciones de 1 g, dicha fraccion a cromatografia en fase nor-mal
usando una columna Lobar Lichropred Si 60 y, como fase movil mezclas de n-
Hex:AcOEt. La primera mezcla empleada fue rc-Hex:AcOEt (9:1), pero tras pasar un volu-men
elevado de eluyente, la mayoria de los compuestos permanecian en la columna, lo que
condujo a decidir llevar a cabo un percolado de polaridad ascendente. Este aumento progre-sivo
de polaridad permite la elucion de los compuestos mas polares. El percolado se llevo a
cabo con las siguientes proporciones de ^-Hex:AcOEt: (9:1); (7:3); (5:5); (3:7) y (0:10),
modificandolas conforme avanzaba la separacion.
Se obtuvieron 8 fracciones, que fueron sometidas a espectroscopia de RMN, tras lo
cual se prosiguio el estudio con la fraccion LMr4 (Fr-1). La purification final de esta frac-cion
se llevo a cabo a traves de cromatografia de alta presion HPLC usando una columna de
fase normal preparativa u- Porasil en rc-Hex:AcOEt (95:5). Tras recolectar los tubos y ver el
comportamiento en TLC, procedimos a agrupar en 7 fracciones. Los datos espectroscopicos
correspondientes a cada una de las fracciones lleva a seguir el estudio de la fraccion LM-Frl-
E, la cual es sometida nuevamente en las mismas condiciones a cromatografia de HPLC.
Se obtuvieron cinco fracciones, de las que de la fraccion 4 se logro purificar completamen-te
el compuesto I.
Procedimientos espectroscopicos generales utilizados en la elucidacion
estructural de los metabolitos aislados
Resonancia magnetica nuclear: Para la realization de los experimentos de RMN se
utilizaron los espectrometros BRUKER® AVANCE 500 MHz y 600 MHz, de acuerdo a las
necesidades. Los experimentos 'H, 13C, COSY, HSQC, HMBC y ROESY, fueron realizados
usando los programas suministrados por la casa BRUKER. En todos los casos se empleo
CDC13 (99.9%) como disolvente, usando como referencia interna la senal de CHC13 residual
para *H y 13C (7.26 ppm y 77.2 ppm, respectivamente). Los datos de adquisicion se procesa-ron
con el programa MestReC (V 4.8.6.0).
Absorcion en el infrarrojo: El experimento de IR fue realizado en un espectrofoto-metro
FT-IR BRUKER®, modelo IFS-55. El espectro fue registrado empleando disolucion
del producto en CHC13 seco sobre una pastilla de NaCl.
Rotacion optica: La determination de la actividad optica para el producto se realizo
empleando un polarimetro PERKIN-ELMER®, modelo 241, a una temperatura de 20 °C y
usando la linea D del sodio (k = 589 nm). El producto fue disuelto en CHC13 seco y se
empleo una celda con longitud optica de 1 dm.
Espectrometria de masas: Los espectros de masas fueron obtenidos de un espectro-metro
VG-Autospec FISONS®.
Datos fisicos del li-dihidrorodophytin (I): ver tabla 1.
40
Ensayos de bioactividad frente a lineas celulares tumorales
Las lineas celulares seleccionadas para el desarrollo de los ensayos de bioactividad
fueron lineas de tumores solidos A2780 (ovario) HBL-100 (mama), HeLa (cerviz), ISHIKA-WA
(endometrio), SW1573 (pulmon) y WiDr (colon).
Cultivo de celulas tumorales: Las celulas se cultivaron en medio RPMI 1640 con
un suplemento de suero fetal bovino inactivo (5%) y L-glutamina (2 mM), utilizando un
incubador a 37 °C en atmosfera con 5% de C02 y una humedad del 95%.
Ensayo de viabilidad/toxicidad: Los ensayos se realizaron empleando el metodo de
sulforodamina B (SRB) del NCI [18] con pequenas modificaciones. Las celulas tumorales
se cultivaron en monocapa en placas de 96 pocillos Los compuestos aislados rueron disuel-tos
en DMSO a 400 veces la concentracion maxima de ensayo, que es 25 uM. Los pocillos
control rueron expuestos a una cantidad equivalente de DMSO (0,25% v/v). Cada compues-to
fue unicamente ensayado en una ocasion con concentraciones dentro del rango entre 1 y
25 uM. Transcurrido el tiempo de incubacion de las celulas expuestas a los compuestos de
interes (48 horas) estas rueron precipitadas en frio con 25 ul de acido tricloroacetico al 50%
(p/v) y fijadas durante 60 minutos a 4 °C. A continuation, se llevo a cabo el ensayo colori-metrico
con sulforodamina B, midiendo la densidad optica de cada pocillo a 492 nm utili-zando
un lector de microplacas PowerWave™ XS (Bio-Tek® Instruments, Inc.). A los valo-res
de absorbancia se les aplico una correction de fondo cuantificada en los pocillos que solo
contienen medio de cultivo. El porcentaje de crecimiento para cada concentracion de com-puesto
empleado se calculo con respecto a los pocillos control, a partir de la diferencia de
densidad optica al inicio y al final del tiempo de exposition al compuesto. Finalmente, la
actividad biologica se expreso en terminos de GI50 (concentracion inhibitoria del 50%).
3. RESULTADOS Y DISCUSION
Elucidacion estructural
El compuesto I fue aislado como un solido incoloro amorfo. La formula molecular
fue establecida como C15H20O81Br35Cl, indicando cinco grados de insaturacion, en base al ion
molecular a m/z 332.0401 de su espectro de masas de alta resolution, asi como a los 15 ato-mos
de carbono observados en el experimento de RMN I3C (Fig 2). Los desplazamientos
quimicos de carbono, asi como las multiplicidades determinadas en el experimento HSQC
editado, permiten hacer la siguiente aproximacion en cuanto al tipo de carbonos presentes en
la molecula: un metilo (5C 12.5), cuatro metilenos (5C 29.4, 31.4, 33.6, 38.0), nueve metinos
de los cuales cuatro son olefmicos (8C 62.1, 63.9, 73.8, 77.0, 78.8, 112.2, 127.3, 129.9 y
141.5) y un carbono cuaternario (8C 82.0). Por otro lado, en el espectro de RMN 'H (Fig 3),
la senales mas relevantes son la de un proton acetilenico a 8H 2.87, asi como la de un meti-lo
triplete a 5H 1.09, cuatro protones sobre heteroatomos a 5H 3.96, 4.06, 4.07 y 4.34, y cua-tro
senales de protones sobre dobles enlaces a 5H 5.65, 5.87, 5.93 y 6.23.
El analisis del experimento COSY (Figs. 4 y 5) permitio establecer los sistemas de
acoplamiento que agrupan a todos los protones pertenecientes a un mismo sistema de spin
en la molecula. En este caso se trata de un sistema de spin amplio donde la correlation entre
los protones del mismo facilita, en gran medida, la elucidacion de la molecula. Asi, partien-do
de la senal 5H 1.09 ppm, correspondiente al grupo metilo segun su desplazamiento qui-
41
tV 141.5
6C 129.9 «v 112.2
5C 78.8
A..82.H*
mm i" pflflww twmm**m*"ttmmm4\m#mM
5C 77.0
» dc 63.9
5C 73.8
<v.29.4
6, 12.5
m^mmmmmm m
140 100 50 20
Figura 2.- Espectro RMN 13C del compuesto I.
dH6.23
aH?.8"
<>H5.93 Oh5-65
6H4.0"
oH4.06
oH4.34
H
oH3.96
i 1
dH2 .87
LJJ
SH1.0S>
5.00 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00
Figura 3.- Espectro RMN 'H del compuesto I.
mico (H3-15), se observa correlacion con una senal que integra para dos protones y que
corresponde con el metileno situado a 5H 1.94 y 2.01 (H2-14). Esta senal tiene acoplamien-to
con una situada a §H 3.96 (H-13), zona que corresponde a los protones unidos a carbonos
con heteroatomos, acoplada asimismo con una senal con desplazamiento muy cercano, lo
cual nos hace asumir la presencia de otro proton unido a carbono con heteroatomo. Esta ulti-ma
senal aparece a 5H 4.06 (H-12). Partiendo de ella, encontramos otra correlacion con las
dos senales de otro metileno diastereotopico a 5H 2.22 y 2.63 (H2-l 1), que a su vez muestran
conectividad con una centrada a 5H 5.93 (H-10), la cual integra para un solo proton y corres-ponde
a la zona de los alquenos. El segundo acoplamiento de esta senal es con otro de los
metinos vinilicos situado a 5H 5.87 (H-9), que a su vez conecta con los protones del metile-no
centrados a 5H 2.60 y 2.75 (H2-8). Continuando con el sistema de spin, vemos que las
senales de este metileno se correlacionan con la senal de metino sobre heteroatomo a 8H 4.07
(H-7), y esta con una senal perteneciente a la misma zona del espectro y situada a 5H 4.34
(H-6). A partir de esta serial, entramos en la ultima secuencia de conectividades con el meti-leno
a 5H 2.58 y 2.68 (H2-5), de este con el metino oleflnico a 5H 6.23 (H-4), que a su vez
esta correlacionado con el tambien metino sobre doble enlace a 5H 5.65 (H-3).
42
Figura 4.- Experimento COSY, donde se indican las conectividades 'H-'H correspondientes a la secuencia entre las
posiciones 15 y 11 de la molecula.
L k
H ft
>|.;.:::::;::::;::::::::::::;|:
Jl/LiJL
-t*<a> q
Figura 5.- Zona ampliada del espectro COSY entre 1.8 y 6.6 ppm, donde se indican las conectividades 'H-'H
correspondientes a la secuencia entre las posiciones 1 1 y 3.
43
Es hasta este punto donde nos permite estudiar la molecula el experimento COSY,
habiendo permitido asignar los protones de 13 carbonos de forma lineal y estableciendo la
siguiente secuencia:
5H 1.09 (H3-15) <-> 5H 1.94/2.01 (H2-14) <-» 5H 3.96 (H-13) <-> 5H 4.06 (H-12) <- 5H
2.22/2.63 (H2-ll) «-> 5H 5.93 (H-10) «-> 5H 5.87 (H-9) <-+ 5H 2.60/2.75 (H2-8) <-> 5H 4.07 (H-
7) <-> 5H 4.34 (H-6) <^ 5H 2.58/2.68 (H2-5) «- 5H 6.23 (H-4) <- 5H 5.65 (H-3).
Fragmento COSY
A continuacion, a traves del experimento HSQC, cada serial de proton se relaciono
con su correspondiente serial de carbono (Figs 6, 7, 8), estando en condiciones a traves del
estudio del experimento HMBC, de interconectar el sistema definido de spin con la parte de
la molecula aun no identificada.
Figura 6.- Primera section ampliada del espectro HSQC del compuesto I.
44
_A™ k A |
C-6
# 60.0
65.0
70.0
- CD
® 6 ™
80.0
-
4.00 3.50 3.00
Figura 7.- Segunda seccion ampliada del espectro HSQC del compuesto I.
_jL_JJ
60
70
_j 80
90
100
_
i ©
C-9
(-4
100
120
130
140
6.00 5.50
Figura 8.- Tercera seccion ampliada del espectro HSQC del com-puesto
I.
45
Para llevar a cabo el analisis HMBC (Fig 9) nos centramos en la serial de H-3 (5H
5.65). Su correlacion con el C-5 (5C 38.0) y con la serial de carbono situada a un desplaza-miento
quimico de 77.0 ppm nos hace asumir que esta ultima debe tratarse de C-l. Por otra
parte, la correlacion que se establece entre H-4 (5H 6.23) y la senal de carbono a 8C 82.0
permite identificar a C-2, habiendo completado el esqueleto carbonado de la molecula. La
presencia de este acetileno terminal esta de acuerdo con la absorcion de IR obtenida a 3292
cm-1 (Tabla 1).
Una vez establecido el esqueleto carbonado, el acoplamiento HMBC entre H-6 (8H
4.34) y C-l 2 (5C 78.8) (Fig 10) permite determinar el cierre de un anillo entre los carbonos
6 y 12 mediante un enlace eter, y asi corroborar con este heterociclo de 8 miembros y los
enlaces multiples descritos, el numero de insaturaciones determinadas en el espectro de
masas.
Finalmente, de acuerdo con los espectros de masas y los desplazamientos quimicos
observados, el heteroatomo unido a C-l 3 debe ser un bromo, por lo que el heteroatomo res-tante
en la posicion C-7 debe ser el cloro. Asi se establece la estructura plana del compues-to
I (Fig 11).
En el siguiente paso se trataron los aspectos configuracionales de la molecula, por un
lado las geometrias de los dobles enlaces, y por otro la estereoquimica relativa del cierre del
heterociclo y del centro estereogenico en C-7. En el primer caso nos fijamos en el desplaza-miento
de proton del acetileno, asi como en las constantes de acoplamiento de los protones
vinilicos. Asi, el proton acetilenico sale con un desplazamiento inferior a 3 ppm, 5H 2.87,
caracteristico de un sistema trans enino conjugado, lo que se confirma con la constante de
-A
jiaJUil. /A aK aa_
30
H-3/C-5
[
(/"~\^x
111
^^™ Fragmento COSY
«-0
^ ^ Correlacion HMBC
60
70
- H-3/C-1
H-4/C-2 80 ^m -
6.20 6.10 6.30 5.90 5.80 £ .70 5.60
Figura 9.- Experimento HMBC ampliado del compuesto I.
46
fi
;
'J_
Fragmento COSY
Correlation HMBC _
* H-6/C-12
Figura 10.- Experimento HMBC ampliado del compuesto I.
Figura 11.- Estructura plana del compuesto I.
acoplamiento "grande" entre los protones
olefmicos H-3 y H-4, %.4 = 15.7 Hz.
Respecto al doble enlace en las posiciones
C-9 y C-10, se define su configuracion
como cis al presentar valores de constantes
de acoplamiento "medianas" 3J8_9 = 7.5 Hz
(Tabla 1).
En el segundo caso, hacemos uso del
experimento de ROESY. Asi se observa
correlation tipo ROE entre los protones H-
6 y H-7 mientras que el proton H-12 no
muestra ningun acoplamiento con estas
sefiales (Fig 12).
Se puede concluir que los protones
H-6 y H-7 se encuentran en la misma cara de la molecula mientras que H-12 en la opuesta.
Esto nos permite establecer las configuraciones relativas de estos centros como 6 S*, 7 S* y
12 R*. Respecto al ultimo centro quiral presente en la molecula, C-13, no nos rue posible
establecer su configuracion relativa a traves de este experimento, al encontrarse situado con
libre giro en una cadena lateral. Sin embargo, al consultar la bibliografia, y a pesar de obser-var
ligeras diferencias en la actividad optica con los datos publicados, podemos afirmar que
nuestros resultados se ajustan bien con los del compuesto conocido ii-dihidrorhodofitin
[14], cuya configuracion absoluta es la que se muestra en la figura 13.
47
[apD = +107.4 (c 0.19, CHCI3)
IR vmax (CHCI3): 3292, 3027, 2966, 2935, 2101, 1734, 1657, 1454, 1355, 1263, 1093,962.
HRMS/77/z: 332.0401 (calc. 332.0366, C 15H20O35
CI
81 Br [M+-H]) y 295.0698 (calc. 295.0698,
C15H20O79Br [K/T-H-CI]).
RMN 13C y 1 H (CDCI3 ):
N°de
Carbono
5
13C
(ppm)
5 1 H
(ppm)
Multiplicidad J (Hz)
77.0 2.87 d 1.9
2 82.0
3 112.2 5.65 dd 1.9; 15.7
4 141.5 6.23 ddd 6.7;8.7;15.7
5 38.0 2.58/2.68 m/m
6 73.8 4.34 ddd 0.8;5;8.9
7 63.9 4.07 m
8 33.6 2.60/2.75 m/ddd 7.8;7.5;15
9 127.3 5.87 ddd 7.5;7.5;10.5
10 129.9 5.93 ddd 7.5;7.3;10.5
11 31.4 2.22/2.63 ddd/m 2.0;7.3;15.3
12 78.8 4.06 m
13 . 62.1 3.96 ddd 14.3;4.6;9.2
14 29.4 1.94/2.01 dq/dq 7.3;1.6;14.8/2.9;7.3;14.8
15 12.5 1.09 dd 7.3;7.3
Tabla 1.- Datos fisicos del compuesto I.
Br////,,/,
Figura 13.- Configuracion absoluta del
E-dihidrorhodofitin.
Figura 12.- Experimento ROESY del compuesto I.
48
La molecula aislada se trata de la acetogenina £-Dihidrorhodofitin, una acetogenina
heterociclica de anillo de ocho miembros con un sistema enino conjugado terminal. Esta
molecula se aislo por primera vez en el ano 1988 por el grupo de Manuel Norte en el Centro
de Productos Naturales Organicos "Antonio Gonzalez" de la Universidad de La Laguna. Una
vez obtenida la informacion de los datos fisicos del compuesto de nuestro trabajo, se com-paro
con aquellos publicados. Asi, se vieron ligeras diferencias entre los valores de despla-zamiento
quimico de carbono y proton de la primera elucidacion con los de nuestro estudio.
No obstante, los acoplamientos y las correlaciones ROE permiten ajustar los datos con los
de Norte et al. [14] confirmando asi que la molecula aislada corresponde a E-Dihidrorhodofitin.
ACTIVIDAD BIOLOGICA DEL £-DIHIDRORHODOFITIN
Los ensayos de citotoxicidad fueron llevados a cabo por el grupo de Jose. M. Padron
del Instituto Universitario de Bio-Organica "Antonio Gonzalez" (BioLab). Las lineas celu-lares
frente a los que se ensayo fueron tumores solidos de ovario, mama, cerviz, endometrio,
pulmon y colon. En la Tabla 2 se recopilan los valores de las concentraciones inhibitorias del
crecimiento del 50% (GI50 ) para el compuesto analizado.
ii-Dihidrorhodofitin
Linea
celular
Gl™M ExP
10/ V.^Cl
A2780 2,2E-05 1
y-o "^ 3
Br/i,./ 3
HBL-100
HeLa
2,5E-05
2,5E-05
1
1
ISHIKAWA 2,5E-05 1
WiDr 2,5E-05 1
Tabla 2.- Datos de inhibition del compuesto frente a las lineas celulares.
A la luz de los resultados se puede observar que, la acetogenina aislada no presento
actividad significativa frente a ninguna de las lineas celulares tumorales ensayadas.
Al realizar una revision bibliografica sobre estudios de bioactividad con C 15 acetoge-ninas,
destaca que los compuestos que presentaban actividad [1] [12], en general tenian en
comun el poseer en su estructura un eter ciclico de 8 miembros y la presencia de grupos fun-cionales
oxigenados (grupos hidroxilo o acetilo). Asimismo, cabe destacar que la isomeria
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geometrica del sistema enino tambien jugaba cierto papel en los mecanismos de actividad,
mostrando mejores resultados los derivados cis. Comparando estos hechos con la estructura
de la ^-dihidrorhodofitin podemos senalar que quizas, la causa de que este compuesto no
tenga actividad frente a las lineas celulares estudiadas, puede estar relacionada con la ausen-cia
de grupos hidroxilos en posiciones tales como C-9 y C-10, donde existe un doble enla-ce,
asi como con la geometria trans-enino que presenta.
4. CONCLUSIONES
El estudio preliminar quimico de la especie Laurencia microcladia recolectada en la
isla de Fuerteventura, rinde como uno de los metabolitos mayoritarios, una sustancia halo-genada
con esqueleto carbonado C15 no terpenico. El compuesto se trataba de la acetogeni-na
conocida is-dihidrorhodofitin. Dicho compuesto no mostro actividad antiproliferativa sig-nificativa
frente a las lineas celulares de tumores solidos ensayadas. Al comparar su estruc-tura
con la de otras acetogeninas activas de este tipo en la literatura, destaca la ausencia de
grupos oxigenados en posiciones C9-C10 y su geometria trans-zmno como posibles causas
de su inactividad.
5. AGRADECIMIENTOS
Nuestro agradecimiento al Lcdo. Adrian Gutierrez. Este trabajo formo parte del tra-bajo
de investigation final de Master Oficial de Biotecnologia MCD 2007/0001 1 de la Lcda.
Eva Aylagas Martinez y ha sido, en parte, financiado por los proyectos del MEC-Ministerio
de Education y Ciencia (CGL2007-60635/BOS; CTQ2008-06754-C04-01/PPQ). Los ensa-yos
de bioactividad fueron llevados a cabo por C. Rios-Luci y J. M. Padron (BioLab,
Instituto Universitario de Bio-Organica "Antonio Gonzalez, Universidad de La Laguna)
6. BIBLIOGRAFIA
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