Laurencia deondroidea (Ceremiales, Rhodomelaceae) en Canarias: I. Estudio preliminar químico

              Rev. Acad. Canar. Cienc, XXII (Num. 3), 11-35 (2010) (publicado en octubre de 2011)
LAURENCIA DENDROIDEA (CERAMIALES, RHODOMELACEAE)
EN CANARIAS. I. ESTUDIO PRELIMINAR QUIMICO
M. Machin-Sanchez1
, M.a L. Souto2
, E. Aylagas1 & M. C. Gil-Rodriguez1
1 Departamento de Biologia Vegetal (Botanica). Universidad de La Laguna
38071 La Laguna, Tenerife, Islas Canarias. mmchin@ull.es
2 Institute- Universitario de Bio-Organica "Antonio Gonzalez". Universidad de La Laguna
Astrofisico Francisco Sanchez 2. 38206 La Laguna, Tenerife, Islas Canarias
RESUMEN
Las algas rojas del genero Laurencia destacan en el campo de los productos natura-les
por la produccion de novedosos metabolitos secundarios halogenados, de naturaleza ter-penica
y no terpenica. Estos compuestos estan relacionados con la defensa quimica natural
de las mismas, siendo por tanto de interes biotecnologico.
Este trabajo aborda el estudio quimico preliminar de Laurencia dendroidea, aislando-se
dos sesquiterpenes ciclicos halogenados que aunque ya conocidos, demostraron poseer
actividad antiproliferativa sobre lineas celulares rumorales humanas.
Palabras clave: Algas, Canarias, Laurencia dendroidea, Rhodophyta, sesquiterpenos
ciclicos halogenados.
ABSTRACT
The red seaweeds of Laurencia genus are characterized by the production of natural
products leading new secondary halogenated metabolites, either terpenic or non terpenic.
These substances are related with natural algae defences, which result in a high biotechno-logical
interest.
In this paper, we made the preliminary chemical study of Laurencia dendroidea. Two
known cyclic halogenated sesquiterpens were isolated, which showed antiproliferative activ-ity
against those cellular lines proved.
Key words: Seaweeds, Canary Islands, Cyclic halogenated sesquiterpenes, Lauren-cia
dendroidea, Rhodophyta.
1. INTRODUCCION
Las algas rojas del complejo Laurencia estan siendo ampliamente estudiadas, tanto
desde el area de la taxonomia como de la quimica. Este interes se debe a dos factores prin-cipales.
En primer lugar, muestran una alta diversidad especifica, estando representadas por
11
aproximadamente 180 especies [17] distribuidas en los mares tropicales, subtropicales y
templados de todo el mundo [29]. Hoy en dia el complejo Laurencia esta integrado por cinco
generos distintos, definidos en base a evidencias morfologicas y moleculares: Laurencia
sensu estricto [22], Osmundea Stackhouse [34], Chondrophycus (Tokida & Saito) [14],
Palisada (Yamada) Nam [32, 33] y Yuzurua Martin-Lescanne et al, [27].
En segundo lugar, estas macroalgas marinas constituyen una importante fuente natu-ral
de metabolitos secundarios halogenados especificos, con caracteristicas estructurales y
propiedades farmacologicas unicas, para los que se han descrito entre otras, actividad cito-toxica,
antitumoral y bactericida [43]. Por esta razon, se consideran buenos candidatos para
su aplicacion en el campo de la biotecnologia medico-farmaceutica. El uso de herramientas
quimicas en el estudio de las algas del complejo Laurencia, ademas de permitir la identifi-cacion
de nuevas sustancias activas con potencial farmacologico [1], puede contribuir, por
medio de aproximaciones quimiotaxonomicas, a la ordenacion de las especies del complejo
y a la caracterizacion de sus poblaciones.
Actualmente, se ha realizado el estudio quimico de mas de 60 especies del genero
Laurencia y unos 600 compuestos halogenados distintos han sido elucidados. La sintesis y/o
almacenamiento de dichos metabolitos secundarios tiene lugar en los corps en cerise, inclu-siones
citoplasmaticas de las celulas corticales presentes solo en aquellas especies producto-ras
de compuestos halogenados [42, 43, 44, 45]. Estos, de acuerdo con su origen biogenico,
se reunen principalmente en moleculas de naturaleza terpenica y no terpenica. Entre los ter-penos,
los mas abundantes son los sesquiterpenes, mientras que el grupo de los no terpeni-cos
esta liderado por C15 acetogeninas [13, 42, 43]. En la actualidad se siguen elucidando
novedosas y prometedoras estructuras de compuestos halogenados presentes en las especies
de Laurencia [1], sustancias que junto con otras muchas de origen marino han abierto, en la
ultima decada, nuevas lineas de investigacion en el campo de la biotecnologia (industria
medico-farmaceutica, cosmetica, nutricional, agroquimica, etc.).
En este trabajo abordamos el estudio quimico preliminar de Laurencia dendroidea
(Hudson) Lamouroux, taxon que habia sido confundido, en Canarias, con L. majuscula
(Harvey) Lucas [4, 26]. De ella se han aislando dos sesquiterpenes ciclicos halogenados que
aunque ya conocidos, demostraron poseer actividad antiproliferativa sobre lineas celulares
tumorales humanas.
2. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA
Estudio de sesquiterpenes ciclicos halogenados implicados en la defensa quimica de
Laurencia.
Las investigaciones quimicas del genero Laurencia realizadas para determinar la
naturaleza de metabolitos secundarios, comenzaron con Obata & Fukushi [36], en un estu-dio
sobre el aceite esencial del alga Laurencia glandulifera Kiitzing. Los resultados refle-jaron
que el grupo de metabolitos secundarios mayoritario era el de los sesquiterpenes
[36]. Desde entonces, en el campo de investigacion de los productos naturales de origen
marino, las macroalgas del genero Laurencia constituyen un taxon de gran importancia, al
ser capaces de producir una notable variedad de metabolitos secundarios, en su mayoria
halogenados.
12
Las especies del genero Laurencia que poseen corps en cerise en sus celulas cortica-les
externas son las unicas, dentro del complejo Laurencia, en las que se ha constatado la
existencia de estos compuestos polihalogenados [11, 42, 43, 44, 45]. La riqueza de estas sus-tancias
especificas y su biosintesis ha despertado especial interes debido, a que los terpenos
en si mismos, son precursores de muchos metabolitos bioactivos. La familia de enzimas
vanadium haloperoxidasas podria ser la responsable de la reaccion de ciclacion de dichos
compuestos, ya que enzimas de esta naturaleza han sido aisladas a partir de algas producto-ras
de terpenos ciclicos halogenados [3, 48]. Un ejemplo de ello es el aislamiento de vana-dium
bromoperoxidasa (V-BrPO) a partir de extractos de Laurencia pacifica Kylin, llevado
a cabo por Carter-Franklin et al. [6, 7]. En estos trabajos se demuestra la action catalitica de
V-BrPO y su implication en la bromacion y ciclacion de monoterpenos como el geraniol y
el nerol, los cuales originan estructuras ciclicas que son encontradas en numerosos metabo-litos
terpenos bromociclicos marinos. Por lo tanto, parecen existir evidencias del papel cata-litico
de V-BrPO en la biosintesis de los sesquiterpenes ciclicos bromados presentes en las
algas rojas [7], aunque la estructura de esta enzima en las algas del genero Laurencia no ha
sido caracterizada [43].
Actualmente, numerosos investigadores se esfuerzan en conocer la funcion, la dina-mica
de produccion y almacenaje de los productos naturales polihalogenados contenidos en
los corps en cerise. Muchos de estos compuestos poseen entre otras, propiedades insectici-das
[10, 12], actividad antibacteriana [5, 20, 45] y actividad repelente de herbivoros [18, 21,
37]. Todas estas caracteristicas llevan a su calificacion como metabolitos secundarios espe-cificos
destinados a la defensa quimica natural de Laurencia. Por ello, son buenos candida-tes
en el campo de la biotecnologia medico-farmaceutica.
Un caso interesante de metabolito sesquiterpenico ciclico halogenado con actividad
biologica es el elatol que se aislo por primera vez en 1974 a partir de Laurencia elata (C.
Agardh) Hooker & Harvey [41]. Desde su elucidation, ha sido aislado en numerosas ocasio-nes
y muchas veces, de forma mayoritaria, a partir de otras especies de Laurencia como
Laurencia obtusa (Hudson) Lamouroux [2, 37, 39], Laurencia majuscula (Harvey) Lucas
[11, 28, 44, 46, 47], Laurencia rigida J. Agardh [9], Laurencia microcladia Kiitzing [25] y
Laurencia cartilaginea Yamada [19].
Recientemente, un trabajo de Salgado et al. [39] sobre compartimentacion celular,
transporte y exocitosis de compuestos halogenados aislados del alga L. obtusa, sento bases
solidas para explicar la produccion mayoritaria del elatol y su posible significado ecologico.
El estudio evidencia el papel que juega el cloroplasto en la sintesis de los compuestos halo-genados
dependiente de la actividad de haloperoxidasas. Tambien plantea la existencia de
fenomenos de transporte especifico de pequenas vesiculas cargadas de dichos metabolitos
hacia los corps en cerise, dirigidas por microfilamentos de actina y de miosina no conven-cionales.
Ademas, sugiere un mecanismo de exudation del elatol hacia el medio externo,
mediado por vesiculas que viajan desde los corps en cerise hacia las paredes de las celulas
corticales externas. Esta liberacion tendria como objetivo la elimination de los microepifi-tos
localizados en el talo o bien, la repulsion de los potenciales depredadores. Asi, se expli-caria
el papel del elatol en la defensa quimica del alga [poder antifouling, inhibition del esta-blecimiento
del bivalvo Perna perna [8], papel repelente frente a determinados herbivoros
[16, 18, 37]]. Por ultimo, en este trabajo revelan igualmente un proceso de degradation de
los corps en cerise y consecuente liberacion intracelular de altas concentraciones de com-puestos
halogenados. Este fenomeno lo relacionan con procesos de muerte celular progra-mada,
evento ya descrito en Dunaliella tertiolecta Butcher (Chlorophyceae, Volvocales) [40]
13
y en Volvox carteri (Chlorophyceae, Volvocales) [35] como mecanismo alternative) en res-puesta
al incremento en el nivel de estres ambiental [39].
Teniendo en cuenta todo lo expuesto anteriormente, queda patente la aplicacion e
interes que este tipo de sustancias pueden tener en diferentes campo de las ciencias.
3. MATERIAL Y METODOS
Recoleccion y estudio preliminar de las muestras
Las muestras de Laurencia dendroidea se recolectaron manualmente, durante la baja-mar,
en diferentes localidades de las islas del Archipielago Canario; en costas expuestas al
oleaje, sobre sustratos rocosos del eulitoral inferior o en los primeros metros del sublitoral.
Los ejemplares fueron transportados en neveras desde el punto de muestreo hasta el labora-torio.
Alrededor de 1 .2 Kg de algas frescas libres de macroepifitos, recolectadas en el Puerto
de la Cruz (Tenerife), en septiembre de 2009, fueron congeladas y destinadas al estudio pre-liminar
de sus metabolitos secundarios. Los ejemplares que se utilizaron para identificar el
taxon fueron prensados e incluidos en el Herbario TFC (Tenerife Ciencias, Universidad de
La Laguna).
Estudio quimico
Extraction: Una vez se descongelaron, las algas fueron sometidas durante cinco dias
a un proceso de maceracion a temperatura ambiente, inmersas en una mezcla CHCl3:MeOH
(1:1). Tras este tiempo se obtuvo un primer extracto organico de color verde oscuro que peso
30.71 g, el cual se identifico como M-l. Aproximadamente 60.72 g de residuos de algas, una
vez secos y triturados, fueron sometidos a una segunda maceracion en un Soxhlet con
CH2C12 . Se obtuvo un segundo extracto M-2 que fue debidamente conservado en frio, espe-rando
a un posterior analisis. La eliminacion de los disolventes, en todos los casos, se con-siguio
empleando evaporadores rotatorios Buchi R-200®, equipados con un bano maria a
37°C y bombas de vacio Buchi B-721®.
Marcha cromatografica del extracto M-l: El extracto M-l (Fig. 1) de Laurencia
dendroidea fue en primer lugar, separado por cromatografia de exclusion molecular en porcio-nes
aproximadas de 10 g, haciendo uso de una columna abierta de Sephadex LH-20 de
SIGMA® (600 x 70 mm 0) como fase estacionaria y una mezcla de CHCl3:MeOH (1:1) como
eluyente o fase movil. Esta tecnica cromatografica permitio la separation de los compuestos
con distintos tamanos moleculares, los cuales eluyen por la columna en orden decreciente.
Este proceso se monitoreo por cromatografia en capa fina (TLC) en fl-Hex:Acetona (7:3), uti-lizando
placas cromatograficas de gel de silice 60 G y H de la casa Merck® que fueron reve-ladas
primero, por visualization de las mismas expuestas a radiation ultravioleta (X=254 run)
en un gabinete Spectroline® modelo CM- 10 y segundo, por pulverization con una solution al
4% de acido fosfomolibdico en etanol y posterior calentamiento a 140°C. Las fracciones que
presentaron un mismo comportamiento en TLC fueron reunidas, obteniendose fmalmente
cinco nuevas fracciones: M-lA, M-1B, M-1C, M-1D y M-1E. La eliminacion de los disolven-tes
se consiguio empleando los evaporadores rotatorios anteriormente descritos.
Posteriormente, todas las fracciones fueron sometidas a tecnicas espectroscopicas de
Resonancia Magnetica Nuclear (RMN). Se llevo a cabo para cada una un experimento de ] H,
14
r
ExtractoM-1
30.71 g (x3)
Sephadex LH-20 (600 x 70 mm 0) CHCI3 : MeOH (1:1)
l -H - H - n ~H M-1E
Particion n-Hex:AcOEt (1:1)/MeOH
7.5:2.5 1:1
Media presion Si 60 (400 x 70 mm 0) n-Hex:AcOEt
2.5:7.5 0:1
Lobar Lichropred Si 60 (310 x 25 mm 0) n-
Hex:AcOEt (8:2)
:r_
M- M
1DP1.4.6 I 1DP1.4
'II ,,-'
7 I 1DP1.4.8
HPLC j7-Porasil (150 x 19 mm 0) n-Hex:AcOEt (8:2)
ELATOL ISOOBTUSOL
2.08 mg
I
|
660 Mg I
Figura 1.- Marcha cromatografica para el extracto M-l.
en un espectrometro BRUKER® AVANCE 500 MHz, desarrollado con los programas adqui-ridos
desde la casa BRUKER. Pruebas para las que fueron necesarias la dilution de las frac-ciones
problema en CDC13 (99.9%) y en las que se tomo como referenda interna la serial de
CHC13 residual para 'H 7.26 ppm. Los datos obtenidos del espectrometro fueron procesados
por el programa MestReC Nova (V 4.8.6.0). El examen de las senales en los diferentes
espectros de RMN de 'H llevo a la election de la fraccion M-1D.
Estudio de la fraccion M-1D: La fraccion M-1D peso 6.8 g; esta fue sometida a una
particion debido a la disparidad en el caracter polar de los compuestos contenidos. La parti-cion
se realizo, separando primero los compuestos solubles en una mezcla de «-Hex:AcOEt
(1:1), M-1DP1; y posteriormente, aquellos compuestos muy polares y solubles en MeOH,
M-1DP2. Esta ultima fraccion se reservo para un futuro analisis. La separacion de M-l DPI
se efectuo por cromatografia de fase normal en columna abierta de gel de silice Kieselgel
9385 Merck® (400 x 70 mm 0) utilizando por gravedad como eluyente, sistemas de polari-dad
creciente. Se empleo por tanto, como fase movil, una mezcla A7-Hex:AcOEt en las
siguientes proporciones: (9:1), (7.5:2.5), (1:1), (2.5:7.5) y (100% AcOEt). Para que tuviera
15
lugar una buena separacion de los compuestos, la relacion peso muestra/peso de gel de sili-ce
fue como minimo de 1/200. Su monitoreo se llevo a cabo por cromatografia en capa fina
(TLC) en >7-Hex:AcOEt (1:1), estableciendose cinco nuevas fracciones. El estudio posterior
de las senales, de los diferentes espectros de RMN de 'H de cada una de las cinco fraccio-nes,
permitio escoger la fraccion M-1DP1.4.
Estudio de la fraccion M-1DP1. 4: 1.83 g de M-1DP1.4 se sometieron a una cro-matografia
en columna de media presion fase normal, usando una columna pre-empaqueta-da
Lobar Lichropred® Si 60 (310 x 25 mm 0) y «-Hex:AcOEt (8:2) como fase movil. Una
bomba FLUID METERING modelo RP-SY sirvio para la circulation de los disolventes y de
la muestra. Posteriormente, tras el habitual monitoreo por cromatografia en capa fina (TLC)
en «-Hex:AcOEt (8:2), resultaron ocho fracciones. El analisis de los diferentes espectros de
RMN de 'H de cada una de las ocho fracciones, mostro en M-1DP1.4.2, senales caracteris-ticas
de compuestos de naturaleza terpenica, lo que centra el interes por esta ultima fraccion.
Estudio de la fraccion M-1DP1. 4.2: La purification final se consiguio a traves de
un sistema de cromatografia liquida de alta eficacia (HPLC), marca LKB®, usando una
columna preparativa de fase normal //-Porasil (150 x 19 mm 0) de WATERS®, en n-
Hex:AcOEt (8:2) y flujo de lmL/min; condiciones que permitieron la obtencion de dos
metabolitos, compuestos 1 y 2, que posteriormente fueron elucidados por metodos espectros-copicos
resultando ser los sesquiterpenes conocidos como: elatol e isoobtusol.
Elucidacion estructural de los metabolitos aislados
Resonancia Magnetica Nuclear: La elucidacion estructural de ambos compuestos
se realizo fundamentalmente, por medio de la ejecucion de experimentos de espectroscopia
de Resonancia Magnetica Nuclear (RMN) que se llevaron a cabo en espectrometros BRU-KER
® AVANCE 500MHz y 600MHz, en funcion de las necesidades particulares de cada
molecula. Experimentos 'H, ,3C, COSY, HSQC, HMBC y ROESY desarrollados con los
programas adquiridos desde la casa BRUKER. Pruebas para las que fueron necesarias la
dilution del compuesto problema en CDC13 (99.9%) y, en las que se tomo como referenda
interna la senal de CHC13 residual para 'H y 13C, 7.26 ppm y 77.2 ppm, respectivamente.
Los datos obtenidos del espectrometro fueron procesados por el programa MestReC Nova
(V 4.8.6.0).
Absorcion en el infrarrojo: El experimento de infrarrojo para cada compuesto fue
realizado en un espectrofotometro FT-IR BRUKER®, modelo IFS-55 (F.T.I.R.). El espectro
fue registrado empleando una disolucion del producto en CHC13 seco sobre una pastilla de
NaCl.
Rotation optica: La actividad optica de cada compuesto fue medida en un polarime-tro
PERKIN-ELMER®, modelo 241, a 20 °C, usando la linea D del sodio (X=589 nm). Los
productos fueron disueltos en CHC13 seco; se empleo una celda con 1dm de longitud optica.
Espectrometria de masas: Los espectros de masas fueron realizados en un espectro-metro
VG-Autospec FISONS®.
Datos fisicos del elatol: Aceite incoloro; [a]
25
D= +86.5 (c 0.21, CHC13 ); IR vmax
(CHC13 ): 3476, 3090, 2951, 1646, 1434, 1343, 1210, 1089 y 1033 cm"1
; RMN 13C (150 MHz)
y 'H (600 MHz) en CDC13 , ver tabla 1; HRMS m/z: 334.0516/332.0537 (calc.
334.0513/332.0543, C^H^O^B^Cl/C^H^O^B^Cl, [M+
-H]), 299.0779/297.0849 (calc.
299.0834/297.0854, C 15H22
81 Br/C 15H22
79Br, [M+
-C1]), 253.0967 (calc. 253.0940,
C15H21
35CFC1, [M+
-Br]), 235.1247 (calc. 235.1254, C15H20
35C1, [M+
-Br-OH]).
16
Datos fisicos del isoobtusol: Aceite incoloro; [a]
25
D= +69.7 (c 0.07, CHC13 ); IR
vmax (CHCI3): 3415, 3089, 2928, 1636, 1450, 1246 y 1067 cm" 1
; RMN 13C (150 MHz) y 'H
(600 MHz) en CDC13 , ver tabla 2; HRMS rn/z: 415.9748/413.9760/411.9776 (calc.
415.9754/413.9775/411.9804, C 15H23
81Br2
35Cl/C 15H23
79Br2
37Cl/ C15H23
79Br2
35Cl [M+
-H]),
394.9673 (calc. 394.9600, C15H20
81Br79Br 35C1 [M+
-H20].
Ensayos de bioactividad del elatol e isoobtusol frente a lineas celulares tumora-les:
Los ensayos de inhibicion de crecimiento celular de los compuestos aislados frente a
varias lineas celulares de tumores solidos, fueron llevados a cabo por el personal del
Laboratorio de Bioensayos (BioLab) del Instituto Universitario de Bio-organica "Antonio
Gonzalez".
Cultivo de celulas tumorales: Las lineas celulares seleccionadas para el desarrollo
de los ensayos de bioactividad fueron lineas de tumores solidos A2780 (ovario), HBL-100
(mama), HeLa (cerviz), ISHIKAWA (endometrio), SW1573 (pulmon) y WiDr (colon). Las
celulas se cultivaron en medio RPMI 1 640 con un suplemento de suero fetal bovino inacti-vo
(5%) y L-glutamina (2 mM), utilizando un incubador a 37 °C en atmosfera con 5% de
C02 y una humedad del 95%.
Ensayo de viabilidad/ toxicidad: Los ensayos se realizaron empleando el metodo
de sulforodamina B (SRB) del NCI (Storeng et al, 1990) con pequenas modificaciones.
Las celulas tumorales se cultivaron en monocapa en placas de 96 pocillos. Los compues-tos
aislados fueron disueltos en DMSO a 400 veces la concentracion maxima de ensayo,
25 uM. Los pocillos control fueron expuestos a una cantidad equivalente de DMSO (0,25%
v/v). Cada compuesto fue ensayado por triplicado con concentraciones dentro del rango
entre 1 y 25 uM. Transcurrido el tiempo de incubacion de las celulas expuestas a los com-puestos
de interes (48 horas) estas fueron precipitadas en frio con 25 ul de acido tricloro-acetico
al 50% (p/v) y fijadas durante 60 minutos a 4 °C. A continuacion, se llevo a cabo
el ensayo colorimetrico con sulforodamina B (SRB). Las celulas fijadas se tineron duran-te
15 min con 25 uL de una disolucion de SRB al 0.4%o (p/v) en acido acetico al 1% (v/v).
El exceso de colorante se elimino tras 3-4 lavados con una disolucion de acido acetico al
1% (v/v). Los pocillos se secaron y el colorante se disolvio con 150 uL de una disolucion
de Tris base lOmM en agua miliQ. La densidad optica de cada pocillo fue medida a 492
run utilizando un lector de microplacas [(PowerWave™ XS) (Bio-Tek® Instruments,
Inc.)]. A los valores de absorbancia se les aplico una correccion de fondo cuantificada en
los pocillos que solo contienen medio de cultivo. El porcentaje de crecimiento para cada
concentracion de compuesto empleado se calculo con respecto a los pocillos control, a par-tir
de la diferencia de densidad optica al inicio y al final del tiempo de exposicion al com-puesto.
Finalmente, la actividad biologica se expreso en terminos de GI50 (concentracion
inhibitoria del 50%)
Efecto sobre el ciclo celular: Los cambios relacionados con el ciclo celular se estu-diaron
por medio de citometria de flujo en las lineas celulares HBL-100 (mama), SW1573
(pulmon) y WiDr (colon). Las celulas cultivadas (105-106 celulas/muestra) fueron expuestas
a tiempos variables y a dosis crecientes de ambos compuestos a partir de los valores de GI50 .
Tras la exposicion se incubaron con ioduro de propidio (0.5% p/v). La distribucion del con-tenido
de ADN se midio en al menos 25000 celulas/muestra, siendo posible de este modo
determinar si los compuestos aislados eran capaces de inducir arresto y en que fase del ciclo
estaba teniendo lugar.
17
4. RESULTADOS Y DISCUSION
Elucidacion estructural
Compuesto 1: elatol
El compuesto 1 fue aislado como un aceite incoloro, [a]
25
D= +86.5 (c 0.21, CHC13) y
una formula molecular de C15H22OBrCl, que fue propuesta a partir del estudio por RMN y
confirmada a traves de espectrometria de masas. De este modo, en el analisis del espectro de
masas de alta resolucion se observan dos picos isotopicos principales a m/z
334.0516/332.0537 (calc. 334.0513/332.0543), que corresponden al ion molecular, asi como
los relativos a las fragmentaciones por perdida de agua, cloro y bromo.
El espectro de RMN 13C del compuesto 1 (Fig. 2) muestra senales correspondientes a
carbonos de distinta naturaleza: tres metilos a 5C 19.5, 20.8 y 24.3; cinco metilenos, uno de
ellos olefmico a 5C 25.6, 29.4, 38.0, 38.6 y 116.0; dos metinos en a a heteroatomos a 5C 70.9
y 72.2; asi como cinco carbonos no protonados, uno espiro y tres de ellos tipo sp2
, a 5C 43.2,
49.2, 124.2, 128.1 y 140.8 (Tabla 1). A partir de estos datos se deduce que de los cuatro gra-dos
de insaturacion implicados en la formula molecular, dos son debido a atomos de carbo-no
tipo sp2 (dos dobles enlaces), mientras que, al poseer el resto de los atomos de carbono
presentes en la molecula hibridacion sp3
, los dos grados de insaturacion restantes solo se jus-tifican
por la existencia de dos ciclos en la estructura, ciclos que deben de encontrarse uni-dos
a traves del carbono cuaternario espiranico a 5C 49.2. Estas caracteristicas estructurales
permiten simplificar el analisis estructural a traves de RMN por sistemas de anillos.
C-3 C-2 C-14
C-1 C-5
Hii/H^ wmm mmmmnmtim*mmm^amvimmm*urn WW mmmmmm^mMLJmfmtkWmm
C-13
C-12
C-15
mmm
140 13S 130 125 120 US 110 105 100 9b 90 8S 80 75 70 65 00 S3 SO 45 40 3h 30 2i> 20 15
Figura 2.- Espectro RMN 13C del compuesto 1.
Determination del anillo A
La determinacion del anillo A se inicia con el analisis del espectro de RMN 'H (Fig.
3), centrando la atencion en los dos singletes localizados a 5H 1.10 (H3-12) y 1.11 (H3-13)
que integran para 6 hidrogenos. Senales que indican la presencia de dos grupos metilo, cada
uno con sus tres protones equivalentes que, dada su multiplicidad, estan situados sobre car-bonos
totalmente sustituidos.
El desplazamiento quimico de carbono de cada metilo se determina por medio del
experimento HSQC (Fig. 4), espectro bidimensional que refleja los acoplamientos de ambas
senales de proton con sus carbonos correspondientes, siendo el valor de las mismas 5C 20.8
(C-12) y 24.3 (C-13), respectivamente.
n°C 5C (ppm) 5H (ppm) Multiplicidad J (Hz)
1 38.6 2.40/2.62 d/d 17.3/17.3
2 124.2
3 128.1
4 29.4 1 .84/1 .99 m/m
5 25.6 1.66/1.86 m/m
6 49.2
7 140.8
8 38.0 2.54/2.66 dd/dd 2.6; 14.6/2.9; 14.6
9 72.2 4.18 ddd 3.1,3.1, 3.1
10 70.9 4.65 d 2.9
11 43.2
12 20.8 1.10 s
13 24.3 1.11 s
14 116.0 4.84/5.17 bs/bs
15 19.5 1.73 s
Tabla 1.- Datos de RMN del compuesto 1 (CDC13 ).
El estudio del acoplamiento 'H- 13C de estas senales a dos y tres enlaces en el experi-mento
de HMBC muestra la conectividad de cada serial de proton de metilo con el carbono
del otro metilo singlete, y ademas la correlation de ambos metilos con los carbonos cuater-narios
situados a 5C 43.2 (C-ll) y 49.2 (C-6), asi como con el carbono de un grupo metino
unido a heteroatomo localizado a 5C 70.9 (C-10).
14-13
H-12
1•1-15
1
H-14
4-14'
H-10
H-5'
..
H-9
I
H-8' ^"^
..
H^ir.Hii V__ ^i^L I. .
I
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Figura 3.- Espectro RMN 'H del compuesto 1.
19
H-1
5
H-1
3
H-1
2
H-14'
H-14 H-10
H-9 H-8' H-4' Ih-s'
L L I
H-1, H-1' H-a
c_15o>
C-lS)
C-5| $C-5 Ml
C-4© ©C-4
C-8 C-8
C-1 C-1
20
30
-40
-50
-60
C-10
1
C-9
»
-70
80
90
-100
C-14 C-14 110
• 1
-120
5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2
Figura 4.- Experimento HSQC del compuesto 1
.
Estos datos reflejan que ambos metilos son metilos geminales, situados sobre un
mismo carbono completamente sustituido, carbono que a su vez, esta flanqueado por el car-bono
cuaternario espiro y por un metino sobre heteroatomo (Fig. 5).
Continuando la elucidation estructural del anillo A, a partir del metino C-10, se puede
determinar que a este grupo por el experimento de HSQC, le corresponde la serial que integra
para un solo proton a 5H 4.65 (H-10) (Fig.4). El estudio de la misma y sus conectividades 'H-
'H en el experimento COSY lleva a la definition de un primer sistema spin (Fig. 6): el hidro-geno
centrado a 5H 4.65 se encuentra acoplado con el metino a 8H 4.18 (H-9) y este a su vez
con los protones a 8H 2.54/2.66 de un grupo metileno (H2-8); estableciendo asi oifragmento
1: 5H 4.65 (H-10) ~ 5H 4.18 (H-9) <-> 5H 2.54/2.66 (H-8'/H-8). A traves del experimento
HSQC se asigna a cada proton su carbono: C-10 a 5C 70.9, C-9 a 8C 72.2 y C-8 a 8C 38.0.
Los acoplamientos HMBC a larga distancia entre los protones del metileno H2-8 y los
carbonos, a dos y tres enlaces, completan la asignacion del anillo A, pues descubren el aco-plamiento
a dos enlaces con un carbono cuaternario olefinico a 5C 140.8 (C-7); tambien, a
larga distancia con un carbono de doble enlace exociclico a 5C 116.0 (C-14) y ademas, con
el carbono totalmente sustituido anteriormente establecido C-6. (Fig. 7).
20
C12-H313 o
C13-H312
C11-H313 @C11-H312
C6-H313 ^ C6-H312
C10-H313 fi> C10-H312
I
vAP t/V
Correlaciones HMBC 1 H—^C
Figura 5.- Section del experimento HMBC del compuesto 1, region 1.05< 5H<1.25, 15< 5C<75 ppm. Dibujo de las
principales correlaciones HMBC observadas.
Finalmente, a traves del experimento de HSQC se identifica los desplazamientos de
proton del metileno exociclico C-14 correspondiendo a las dos senales de mayor desplaza-miento
quimico en el espectro de proton, senales que aparecen como singletes anchos a 5H
4.84 y 5.17. (Fig. 4). De esta forma se genera un anillo de ciclohexano cuyas caracteristicas
principales son la presencia de un doble enlace exociclico en la position C-7, la existencia
de dos heteroatomos en C-9 y C-10, y de un gera-dimetilo en C-ll.
Determination del anillo B
La determination del segundo anillo presente en el compuesto 1 comienza conve-nientemente
por el analisis de los acoplamientos a larga distancia del HMBC, a partir del car-bono
espiro comun a ambos sistemas de anillos, el carbono C-6. De este modo, se observan
acoplamientos de C-6 con los protones diasterotopicos de dos metilenos, a 5H 2.40/2.62 y
1.66/1.86, respectivamente (Fig. 8).
El analisis del espectro COSY para los protones anteriores desvela que, el primer
metileno aparece como un sistema aislado (H-l 7H-1), mientras que el segundo se acopla con
un nuevo metileno a 5H 1.84/1.99 constituyendo asi otro sistema de spin ofragmento 2 (Fig.
9): 5H 1.66/1.86 (H-57H-5) <-> 5H 1.84/1.99 (H-47H-4). La asignacion de cada uno de sus
carbonos se completa por medio de las correlaciones de HSQC correspondientes a 8C 38.6
(C-l), 25.6 (C-5)y 29.4 (C-4).
21
Fragmento COSY
MJiL
H-9/H-8'
H-9/H-8 T
5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2
Figura 6.- Corte del experimento COSY del compuesto 1, region 2.0< 5H<5.8 ppm. Dibujo del fragmento COSY
resultante.
En el espectro HMBC, tanto H-17H-1 como H-47H-4 se conectan con dos nuevos
carbonos totalmente sustituidos y localizados en la region del espectro de RMN 13C propia
de los dobles enlaces, C-2 (5C 124.1) y C-3 (8C 128.1).
La elucidation estructural del compuesto 1 concluye con la asignacion del grupo
metilo restante a 5C 19.5, como C-15 en funcion de los acoplamientos tipo HMBC observa-dos
entre su senal de proton singlete a 1.73 y los carbonos C-2, C-3 y C-4 (Fig. 10).
El anillo B se define asi como un ciclohexeno donde el doble enlace totalmente sus-tiruido
se situa entre las posiciones C-2 y C-3 portando respectivamente un heteroatomo y el
metilo C-15 en esas posiciones.
La identification y localization de los heteroatomos en las posiciones C-2, C-9 y C-
10 se realiza de acuerdo con los datos de masas y los valores de desplazamiento quimico de
RMN. Estos concuerdan con la presencia de un bromo en C-10, un hidroxilo en C-9 y un
cloro en C-2.
22
ji/vJiLM
40
C6-H8^ ^ ^
C6-H8'
-50
-60
- • 70
-80
-90
100
-110
C14-H8^ « C14-H8'
^* as
-120
-130
C7-H8 ^ C7-H8'
-140
-150
13 12
Correlaciones HMBC 1H-> 13C
2.9 2.7 2.5 2.3
Figura 7.- Corte del experimento HMBC del compuesto 1, region 2.3< 8H<2.9 40< 8C<150 ppm. Representacion
de las correlaciones HMBC.
aMA Aa Aa _^/^^aJA_
30
40
50
60
C6-H1'
C6-H4 C6-H 4*
2.9 2.7 2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5
Figura 8.- Corte del experimento HMBC del compuesto l, region l.5< 5H<2.9 30< 8C<60 ppm.
23
Fragments COSY
Correlaciones HMBC 1H~^ 13C
2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.
Figura 9.- Seccion del experimento COSY del compuesto l, region l.3< 5H<2.3. Dibujo de las correlaciones COSY
y HMBC relativas a esa zona.
La estructura plana coincide con la del compuesto conocido elatol [25, 41] confir-mando
que se trata de la misma sustancia al determinar que, estereoquimicamente es identi-co
en base a la interaction tipo ROE observada entre H-10, tanto con el metino H-9 como
con los protones del metileno H2-5, asi como por el signo de la rotation optica (Fig. 11).
Compuesto 2: isoobtusol
El compuesto 2 fue aislado como un aceite incoloro, [a]
25
D= +69.7 (c 0.07 CHC13 ).
El espectro de masas de alta resolution mostro un pico a m/z 415.9748 (calc. 415.9754),
413.9760 (calc. 413.9775) y 411.9776 (calc. 411.9804) con intensidad relativa 7, 10, 4, que
corresponde a la formula molecular C15H23OBr2Cl y que indica tres grados de insaturacion.
La interpretation de los datos de los experimentos COSY, HSQC, y HMBC, permitio
realizar las asignaciones de las senales de RMN 'H y 13C, tal como se recoge en la Tabla 2.
De sus datos espectroscopicos se deduce que posee el mismo esqueleto carbonado
que el compuesto 1 diferenciandose unicamente en el anillo B. Asi se observa:
La ausencia del doble enlace totalmente sustituido entre las posiciones C-2 y C-3, lo
que concuerda con un grado menos de insaturacion en la molecula.
El metileno H-l/H-1' ya no se presenta como un sistema aislado sino que aparece
acoplado en el experimento de COSY con un nuevo grupo metino en a a un cloro a 5H 4.47
(H-2) (Fig. 12).
Los cambios en los desplazamientos quimicos: del metilo 15 (5H 1.73 y 8C 19.5 en el
compuesto 1 vs 5H 1 .95 y 5C 32.8 en el compuesto 2), al no estar ahora situado sobre un doble
enlace sino sobre un carbono cuaternario donde se ha adicionado un atomo de bromo; del
propio carbono cuaternario C-3 (5C 128.1 vs 8C 71.1); y del metileno 4 que ha dejado de ser
24
C4-H315
C2-H315
C3-H315
10
20
-30
40
50
110
120
-130
140
150
13 12^¥^A
Correlaciones HMBC 1 H-V3C
1,9 1.8 1.7 1.6
Figura 10.- Corte del experimento HMBC del compuesto 1, region 1.6< 5H<1.9, 10< 5C<50 - 110< 5C<150 ppm.
Dibujo de las correlaciones HMBC de H3
-15.
Figura 11.- Compuesto 1 elatol.
25
n°C 5C (ppm) §h (PPm) Multiplicidad ./(Hz)
1 33.9 2.83/3.13 dd/bd 3.4,15.5/15.5
2 65.2 4.47 m
3 71.1
4 33.2 1.88/2.27 m/m
5 25.6 1.81/2.08 m/m
6 44.0
7 148.1
8 39.4 2.46/2.73 bd/dd 11.9/11.9:12.1
9 69.8 3.69 m
10 76.2 4.45 d 1.9
11 43.7
12 25.6 1.09 s
13 24.9 1.37 s
14 113.8 4.95/5.20 bs/bs
15 32.8 1.95 bs
Tabla 2.- Datos de RMN del compuesto 2 (CDC13 ).
*
-H2-HV
__J12=HJ
Fragmento COSY
_^a_jAA
Hl'd•88
-**Q
OtO
-2.4
«
2.6
2.8
3.0
-3.2
3.4
(30
-3.6
-3.8
-4.0
-4.2
-4.4
-4.6
-4.8
.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.,
Figura 12.- Corte del experimento COSY del compuesto 2, region 2.4<5H<4.8 ppm. Dibujo del nuevo sistema de spin.
26
alilico (5H 1.84/1.99 y 5C 29.4 en el compuesto 1 vs 5H 1.88/2.27 y 8C 33.2 en el compuesto
2) (Figs. 13 y 14).
En funcion de estos datos se concluye que la estructura plana del compuesto 2 es tal
como se muestra en la Fig. 15 y coincide con la del isoobtusol [15, 49] y a//o-isoobtusol [19].
La comparacion de los desplazamientos quimicos de carbono en C-2 y C-3 del compuesto
aislado con los datos publicados de estas dos sustancias (Tabla 3), la ausencia de la correla-tion
ROE clave entre el metilo H3-15 y el proton H-2 tipica de la disposition trans-diaxial
de los atomos cloro y bromo en el a/Zoisoobtusol (Fig. 16), y el estudio del signo de la rota-tion
optica ([a]D= +69.7 para el compuesto 2, [a] D= +33 para el isoobtusol, y [a]D= -33.8
para el a/Zo-isoobtusol) permite afirmar que el compuesto 2 es el isoobtusol.
H-15 H-13 H-12
H-8 IM L
H-1j H-1* H-Sj J
3.5 3.0 2.5
Figura 13.- Espectro de RMN 'H del compuesto 1.
r 1 1
.
H-12
5.2 5.0 &8 4.S 4.4 4.2 4.0 3B 3B 3.4 32 3.0 2.3 Z6 2.4 22 2.0 1.6 1,
Figura 14.- Espectro de RMN 'H del compuesto 2.
Figura 15.- Estructura plana del compuesto 2.
27
Figura 16.- Comparacion de la configuration espacial del isoobtusol y el a//o-isoobtusol. Correlation ROE
entreH3-15yH-2.
n°C Compuesto 2 Isoobtusol >4//o-isoobtusol
C-2
C-3
65.2
71.1
65.2
72.2
57.1
73.2
Tabla 3.- Comparacion de los 5C C-2 y C-3 del compuesto 2 con los datos publicados
del isoobtusol y el a/Zo-isoobtusol.
Bioactividad del elatol y del isoobtusol
Los resultados obtenidos a partir de los ensayos de bioactividad frente a las lineas
celulares tumorales recogidas en las Tablas 4 y 5, indicaron la actividad antiproliferativa de
ambos compuestos.
Elatol Linea celular GI50
A2780 4.6x1
0"7
HBL-100 8.5x1
0"7
HeLa 3.1 x10"6
ISHIKAWA 7.4x1
0"7
SW1573 2.2x1
0"6
WiDr 6.8x1
0"7
Tabla 4.- Valores de GI50 [M] de las diferentes lineas celula-res
ensayadas con elatol.
Isoobtusol Linea celular GI50
A2780 8.2x1
0"7
HBL-100 7.8x1
0"6
HeLa 2.0x1
0"5
ISHIKAWA 7.8x1
0"6
SW1573 2.3x1
0"5
WiDr 5.1 x10"6
Tabla 5.- Valores de GI50 [M] de las diferentes lineas celula-res
ensayadas con isoobtusol.
28
Las moleculas aisladas fueron capaces de inhibir el crecimiento tanto de lineas celu-lares
tumorales caracterizadas por su sensibilidad a los farmacos A2780 (ovario) como de
lineas celulares resistentes WiDr (colon) [38]; sin embargo, la accion de los compuestos fue
diferente. El elatol presento valores de citotoxicidad diez veces superiores a los del isoobtu-sol,
salvo en la linea celular mas sensible A2780, caso en el que los valores de inhibition del
crecimiento son similares. Estas diferencias entre el elatol y el isoobtusol podrian estar indi-cando
una posible relacion estructura-actividad, siendo el responsable de la mayor potencia
del elatol el grupo clorovinil que este posee sobre el ciclohexeno (anillo B). Esta hipotesis
se hace en base a los resultados de trabajos previos, en los que se vincula la actividad anti-proliferativa
de compuestos alquil-cloro-dihidropirano, frente a estas lineas celulares, con la
existencia de un grupo clorovinilo (Fig. 17) [23, 24, 30, 31].
Elatol
ci
Isoobtusol Alquil-cloro-dihidropirano
(R=Alquil)
Figura 17.- Comparacion del elatol e isoobtusol con la estructura general de alquil-cloro-dihidropirano citotoxico.
Por otro lado, los resultados preliminares del efecto de los compuestos sobre las dis-tintas
fases del ciclo celular, caracteristico de cada cultivo ensayado (Tablas 6-8), reflejan la
accion que los mismos estarian ejerciendo en la fase Gl pues, en la mayoria de los casos, es
en esta en la que se observa retention del ciclo celular tras 24 horas de exposition. En todas
las situaciones se advierte la disminucion de la distribution celular en las fases S (excep-tuando
WiDr expuesta a 3 uM elatol) y G2/M. Ademas, se percibe una posible relacion dosis
dependiente en el incremento de la tasa de muerte celular, salvo en el caso del efecto del iso-obtusol
a 15 uM sobre el cultivo de la linea tumoral SW1573, el cual parece ser menos letal
que a 5 uM (Figs. 18-20). Estos resultados se corresponden con la accion que muchos agen-tes
citotoxicos o daninos del ADN muestran, ya que se caracterizan por ser capaces de dete-ner
a las celulas en alguna de las fases de su ciclo y de inducir la muerte celular por apop-tosis
[23].
HBL-100 Live SC G1 S G2/M Muerte
Control 72.1 42.6 13.8 15.4 4.5
Elatol (1 jl/M) 66.7 47.8 6.6 11.9 4.8
Elatol (3/iM) 53.7 34.3 3.9 15.6 17.2
Isoobtusol (5/jM) 67.2 45.8 9.2 12.0 5.0
Isoobtusol (15 jl/M) 65.2 45.5 4.2 15.1 8.8
Tabla 6.- Datos del efecto de los compuestos aislados sobre el ciclo celular de HBL-100.
29
L-J
-2
L 1—
J —
Intensidad Control Intensidad Elato ljlM Intensidad Isoobtusol 5|iM
HBL-100
Gl
— S
G2/M
1 -3
1 ~
Intensidad Elatol 3*iM Intensidad Isoobtusol 3\iM
Figura 18.- Histogramas del efecto de los compuestos aislados sobre el ciclo celular de HBL-100.
SW-1573 Live SC G1 S G2/M Muerte
Control 83.8 47.7 16.7 19.2 4.1
Elatol (1/iM) 73.9 45.1 11.7 16.7 4.8
Elatol (3 /l/M) 73.1 53.0 7.2 12.8 7.1
Isoobtusol (15 jl/M) 78.3 49.9 10.8 15 5.1
Isoobtusol (45 jl/M) 75.4 52.3 8.8 14.1 4.7
Tabla 7.- Datos del efecto de los compuestos aislados sobre el ciclo celular de SW1573.
kIntensidad Intensidad
Control Elatol 1u.M
SW1573
Gl
CO
-2
i
i
00
(0
O
S o 1 _ o
2:
G2/M
1 I -
Intensidad
Elatol 3tiM
Intensidad
Isoobtusol 15|iM
Intensidad
Isoobtusol 45u.M
Figura 19.- Histogramas del efecto de los compuestos aislados sobre el ciclo celular de SW1573.
30
WiDr Live SC G1 S G2/M Muerte
Control 85.1 48.1 17.3 19.1 1.5
Elatol (1/iM) 76.5 55.2 6.4 14.2 3.4
Elatol(3/iM) 74.4 53.8 7.1 12.7 5.2
Isoobtusol (5/vM) 76.0 54.2 7.5 13.7 3.4
Isoobtusol (15/iM) 74.3 54.0 5.4 14.4 4.4
Tabla 8.- Datos del efecto de los compuestos aislados sobre el ciclo celular de WiDr.
klk I
Intensidad
Control
Intensidad
Elatol
Intensidad
Isoobtusol
WiDr
Gl
S
G2/M
Intensidad
Elatol 3uM
Intensidad
Isoobtusol
Figura 20.- Histogramas del efecto de los compuestos aislados sobre el ciclo celular de WiDr.
5. CONCLUSIONES
El estudio quimico preliminar de las muestras de Laurencia dendroidea recolectadas
en el Puerto de la Cruz en septiembre de 2009, reflejo que los compuestos halogenados de
naturaleza terpenica, elatol e isoobtusol, son metabolitos secundarios mayoritarios de las
algas que conforman las poblaciones de las Islas, tal y como ya se habia citado en los estu-dios
realizados sobre L. majuscula de Gran Canaria y del sur de La Gomera [28].
En el estudio preliminar de bioactividad, tanto el elatol como el isoobtusol, mostra-ron
una notable actividad antiproliferativa frente a lineas celulares de tumores solidos
(A2780, HBL-100, HeLa, ISHIKAWA, SW1573 y WiDr). El elatol presento mayor citoto-xicidad
que el isoobtusol, hecho que podria estar relacionado con la existencia del grupo clo-rovinilo
presente en el ciclohexeno del elatol. Este grupo funcional se ha revelado como
esencial para la actividad frente a estas lineas celulares en una serie de 2-alquil-4-cloro-5,6-
dihidro-piranos.
El analisis preliminar del efecto que el elatol y el isoobtusol ejercen sobre las fases
del ciclo celular caracteristico de los cultivos ensayados, evidencio cierto poder de retencion
del ciclo celular en la fase Gl, tras 24 horas de exposicion frente a los mismos. Caracteristica
que se podria comparar con la de numerosos agentes citotoxicos o lesivos del ADN.
31
6. AGRADECIMIENTOS
Nuestro agradecimiento al Lcdo. Adrian Gutierrez por su ayuda en el trabajo de labo-ratories
Este trabajo formo parte de la memoria de investigation final de Master Oficial de
Biotecnologia de la Universidad de La Laguna Mention de Calidad: MCD 2007-000111
de Maria Machin Sanchez. Ha sido, en parte, financiado por los proyectos del MEC-Ministerio
de Education y Ciencia-(CGL2007-60635/BOS; CTQ2008-06754-C04-01/PPQ).
Los ensayos de bioactividad fueron llevados a cabo por C. Rios-Luci, L. G Leon y J. M.
Padron (BioLab, Institute Universitario de Bio-Organica "Antonio Gonzalez, Universidad
de La Laguna).
7. BIBLIOGRAFIA
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