Regulación aguda de la musculatura lisa intestinal de ileón y colón de ratón por poliamidas

              Rev. Acad. Canar. Cienc, XIX (Num. 4), 9-27 (2007) (publicado en septiembre de 2008)
REGULACION AGUDA DE LA MUSCULATURA LISA
INTESTINAL DE ILEON Y COLON DE RATON POR POLIAMINAS
M. C. Gonzalez-Montelongo" *, C. M. Ramirez-, J. Marrero-AIonso'-\ R. Marin-
N. Fabelo' \ V. Martin", T. Gomez'" & M. Diaz'"
Departamento de Biologia Animal, Facultad de Biologia
- Departamento de Fisiologia, Facultad de Medicina
"" Institute de Tecnologias Biomedicas (ITB)
Universidad de La Laguna. Tenerife, Islas Canarias
* mcmontel@uli.es
RESUMEN
Las poliaminas son policationes alifaticos esenciales para el crecimiento y desarro-llo
normal de las celulas, estando tambien implicadas en multitud de mecanismos celulares
en estados patologicos. Nuestros resultados demuestran que, tanto las poliaminas naturales
como la poliamina sintetica a-difluorometilornitina (DFMO), provocan la relajacion de la
actividad contractu de la musculatura lisa longitudinal de ileon y colon de raton. El efecto
relajante de estas sustancias ocurre de manera rapida, reversible y dependiente de la dosis.
Todas nuestras evidencias indican que este efecto inhibidor es eminentemente extracelular.
y tiene su origen en interacciones producidas sobre la membrana plasmatica de las celulas
musculares. Mediante analisis farmacologicos, hemos podido concluir que el efecto rela-jante
de las poliaminas sobre el musculo ileal y colonico se debe, por un lado, al bloqueo de
los canales de Ca-^ tipo L, y por otro, a una modulacion positiva de las conductancias a
traves de canales de K . Finalmente, hemos encontrado que el niimero de cargas positi\as
de las poliaminas naturales guarda una clara relacion estructura-funcion con su potencia
inhibidora.
Palabras clave: poliaminas, a-difluorometilornitina (DFMO), canales de Ca- tipo
L, canales de K , actividad peristaltica intestinal.
ABSTRACT
Polyamines are aliphatic polications that are essential for the normal growth and
development of cells, being also involved in many cellular mechanisms responsible for dif-ferent
pathological states. Our results show that both, natural and synthetic pol> amines pro-voke
a dramatic inhibitor} eftect on mouse ileal and colonic contractile activit>. The relax-ing
effect of these compounds occurs rapidly upon exposure to the intestinal muscle, and
takes place in a reversible and dose-dependent manner. Overall, our evidences point to an
extracellular effect triggered by interactions with targets at the plasma membrane of smooth
muscle cells. B) means of pharmacological tools, we have concluded that the relaxing effect
of polyamines are due to both, a blocking effect on L-type Ca-^ channels, and also a posi-tive
modulation of K" conductances at the plasma membrane of intestinal muscle cells.
Finally, our analyses have shown a structure-activity relationship between the number of
positive charges in the polyamine molecule and its inhibitory potency.
Keywords: polyamines, a-difluoromethylornithine (DFMO), L-type Ca'^ channels,
K^ channels, intestinal peristaltic activity.
INTRODUCCION
Las poliaminas naturales, putrescina (Put), espermidina (Spd) y espermina (Spm),
son un grupo de policationes alifaticos (con 2, 3 y 4 cargas positivas a pH fisiologico) que
se encuentran distribuidas ubicuamente tanto en celulas procariotas como eucariotas (PEGG
[20]) y, dentro de estas ultimas, en la gran mayoria de tejidos animales y vegetales (PEGG
& MCCANN [21]). Si bien es cierto que hay muchas funciones biologicas de las poliami-nas
que no se han conseguido dilucidar, es mucho lo que se conoce acerca de su biologia
(HEBY [9]). Se han realizado multitud de investigaciones sobre su biosintesis y degrada-cion,
y acerca de las propiedades moleculares de alguna de las enzimas que intervienen en
estos procesos. Como se muestra en la Figura 1, el precursor para la biosintesis de poliami-nas
en celulas animales es la L-ornitina, un intermediario del ciclo de la urea, derivado del
aminoacido arginina, que es convertida a putrescina por la enzima ornitina descarboxilasa
(ODC; EC 4.1.L17), la primera enzima limitante en la sintesis de las poliaminas. La esper-midina
y la espermina son producidas posteriormente en dos reacciones consecutivas cata-lizadas
por la enzima espermidina sintasa (SRM; EC 2.5.1,16) y espermina sintasa (SMS;
EC 2.5. L22), respectivamente (PEGG & MCCANN [21]; SEILERN & DEZEURE [25]).
En cada uno de estos pasos se incorpora un grupo aminopropilico (APG), proveniente de la
S-adenosilmetionina descarboxilada (SAMdc), reaccion catalizada por la S-adenosilmetio-nina
descarboxilasa (SAMDC; EC 4. L 1.50), generandose 5'-metiltioadenosina (MTA). Si
bien las reacciones llevadas a cabo por las enzimas espermidina y espermina sintasa son
irreversibles, la espermina puede ser convertida a espermidina, y esta a putrescina por la
accion de dos enzimas, la espermina/espermidina N'-acetiltransferasa (SSAT) y la poliami-na
oxidasa dependiente de FAD (PAO; EC 1.5.3.11) (SEILER et al, [24]). La concentracion
de poliaminas en celulas animales esta fmamente regulada, principalmente por alteraciones
en la actividad de la ODC, SAMDC y SSAT, ya que la acumulacion de las poliaminas es
citotoxica.
Los mecanismos por los cuales las poliaminas afectan al crecimiento celular y la pro-liferacion
no se han identificado. Se han encontrado concentraciones altas (mM) de polia-minas
(mM) en tejidos con una tasa de renovacion celular elevada, pero tambien en tejidos
quiescentes (musculo o tejido neural) lo que sugiere que las poliaminas son importantes
tambien para otros procesos que no implican crecimiento. Se ha observado que las poliami-nas,
en general, debido a su naturaleza policationica, son moleculas que potencialmente pue-den
interaccionar con una gran variedad de dianas celulares. Uno de los primeros eventos
descritos en el campo de las poliaminas son los efectos rapidos, entre los que habria que des-tacar
la interaccion con diversos canales ionicos (FICKER et al, [4]; LOPATIN et al, [12])
y otros receptores de membrana, afectando a la excitabilidad membranaria y los sistemas de
segundos mensajeros (SCHUBER [22]). La naturaleza cationica de estas sustancias las
hacen compartir caracteristicas comunes con determinados cationes inorganicos como el
10
Mg-' y el Ca- , aunque, se dan diferencias fundamentales con estos cationes ya que las car-gas
positivas en las poliaminas se encuentran distribuidas a lo largo de la cadena alifatica
(^SCHUBER [22]; WEIGER ^/ ^//., [31]).
En el musculo liso uterino, las poliaminas inhiben la actividad contractil y electrica
(MARUTA et ai, [14]), y en el musculo liso intestinal se ha demostrado que el efecto rela-jante
de las poliaminas esta asociado con el descenso de la cantidad de Ca- libre intracelu-lar
(NILSSON & HELLSTRAND [18]; SEILER et al., [24]). Tambien se sabe que las polia-minas
pueden interactuar con los mecanismos liberadores de Ca- intracelular en musculo
liso y estriado (PALADE [19]; SWARD et al., [27]). Ademas de estos mecanismos de
accion, las poliaminas son capaces de incrementar la sensibilidad al Ca- en la contraccion
del musculo liso permeabilizado por un mecanismo que implica una mayor fosforilacion de
la cadena ligera de la miosina, como resultado de un efecto inhibitorio sobre la acti\ idad
miosina fosfatasa. Con respecto a esto, algunos estudios demuestran que las poliaminas
inducen la sensibilizacion de los sistemas contractiles al Ca- (GONZALEZ-MONTELON-
00 et al., [8]; SWARD et al., [27]; SWARD et al., [28]), promoviendo un incremento del
nivel de fosforilacion de la cadena ligera en tejidos intactos > permeabilizados, sugiriendo
que cuando los niveles de poliaminas fluctuan tambien se ven afectadas las propiedades del
aparato contractil muscular.
Varios estudios han demostrado que las poliaminas y sus deri\ados toxicos tienen
efectos sobre las corrientes de Ca-' activadas por voltaje en neuronas (SCOTT et al., [23]).
Los mecanismos por los cuales las poliaminas interactuan con los canales de Ca-' no estan
claros, pero se sugiere la union directa al canal o a los sitios de regulacion de este (SCOTT
et al., [23]). La espermina en particular (una tetra-amina), esta implicada en el bloqueo \ la
modulacion de ciertos canales ionicos (SCOTT et al., [23]; WILLIAMS [32]). La manera
en la que la espermina promue\ e la relajacion del tejido muscular liso ileal de cerdo es con-secuencia
del bloqueo de los canales de Ca- sensibles a voltaje, tanto desde el lado extemo
como del lado interno de la membrana plasmatica (GOMEZ & HELLSTR.AXD [6]). Debido
a que son moleculas largas y flexibles, pueden interaccionar con el poro de un canal, entrar
a su traves, interactuar con zonas muy amplias de la proteina. y de esta forma modificar una
region membranaria considerable. Sin embargo, otros autores han propuesto que el grado de
hidratacion de la molecula, mas que su flexibilidad. sea el parametro esencial que las con-vierte
en bloqueantes de canales ionicos (WT^IGER et al., [31]). Asi, la aplicacion extrace-lular
de espermina, la mas flexible de las tres poliaminas, probablemente debido a la pre-sencia
de dos atomos de nitrogeno en medio de la molecula (ver figura I), inhibe de forma
reversible y dependiente de la dosis (la concentracion causante del 50% de inhibicion [IC5Q]
es de 1 mM) la actividad mecanica y electrica espontanea del musculo liso de colon de cerdo
(WEIGER et al., [31]), asi como de la vena portal de rata en el rango milimolar (GOMEZ
& HELLSTRAND [6]; NILSSON etal., [17]).
El objetivo principal de este trabajo es dilucidar cual es la naturaleza de la interac-cion
que tienen las distintas poliaminas en la membrana plasmatica del musculo liso intes-tinal
(ileon y colon) de raton. Nuestros resultados muestran que el efecto de la aplicacion
extracelular de las distintas poliaminas (en el rango mM), al igual que el inhibidor de la prin-cipal
enzima biosintetica implicada en la ruta (DFMO), es inhibitorio. rapido y reversible,
sugiriendo que estas moleculas no necesitan entrar en el interior celular para bloquear la
actividad de los canales ionicos y/o receptores de membrana involucrados en el acopla-miento
excitacion-contraccion. Por lo tanto, los efectos de las poliaminas sobre la contrac-cion
del musculo liso intestinal son complejos y necesitan ser caracterizados tanto a nivel
11
de los eventos membranarios como de las vias reguladoras intracelulares. Ya que las vias
reguladoras intracelulares y de segundos mensajeros han sido parcialmente estudiadas por
nuestro grupo (GONZALEZ-MONTELONGO et al, [8]), en este trabajo se han abordado
las interacciones que se desencadenan a nivel de la membrana plasmatica sobre la muscula-tura
lisa intestinal no permeabilizada de ileon y colon de raton.
2. MATERIAL Y METODOS
2. 1. Animales utilizados
Como modelo de estudio se usaron ratones machos Swiss (CDl), con pesos que osci-laron
en tomo a los 30 g. Los animales se adquirieron del Servicio Estabulario de la
Universidad de La Laguna. Los animales tuvieron acceso a comida y bebida ad libitum hasta
el momento del experimento, cumpliendo en todo momento, con los requerimientos del
Comite de Etica de la Universidad de La Laguna para el uso y el cuidado de los animales.
2.2. Preparacion de los tejidos y soluciones
Los animales se anestesiaron con eter dietilico y se sometieron a una intervencion
quirurgica con el fm de acceder hasta el tejido intestinal. Posteriormente se procedio a su
sacrificio. Una vez identificados los distintos tramos intestinales usados en este estudio (ileon
y colon), se extirparon longitudes maximas de 1 .5 cm. A continuacion se procedio a colocar
los tejidos en solucion salina fisiologica (PSS) fria cuya composicion era: 126 mM NaCl, 4.5
mM KCl, 1 mM MgS04, 2 mM CaCl., 1.44 mM Na2P04, 0.56 mM NaP04 y 15 mM gluco-sa
a pH 7.4. La solucion PSS carente de calcio contenia la misma composicion que la solu-cion
salina fisiologica pero en ausencia de CaCK y suplementada con 25 j^M de EGTA.
2.3. Procedimiento experimental
Con el fm de reproducir la actividad normal caracteristica de estos tejidos, los dife-rentes
tramos intestinales se transfirieron a banos de organos en presencia de una solucion
salina libre de Ca-* y a 37 °C en continuo burbujeo, y se les impuso una misma tension basal
de 0.5 g. La solucion de incubacion se reemplazaba cada 15 minutos, hasta que fue eviden-te
la actividad peristaltica caracteristica de cada tramo intestinal.
Tras el periodo de estabilizacion, los tejidos se sometieron a un pulso de 50 mM de
KCl con el fm de alcanzar un maximo de contraccion especifica para cada tejido. Este maxi-mo
de contraccion se determine antes de comenzar cada experimento, con el fm de calcular
el rango contractu dinamico de cada tramo intestinal. Con posterioridad los tejidos eran
lavados con PSS (al menos tres veces) antes de la aplicacion de cada tratamiento.
2.4. Sistema de registro
El estudio sobre la actividad contractu intestinal se realize mediante el registro de la
tension isometrica desarrollada por la musculatura lisa longitudinal.
La fuerza contractu desarrollada por cada tramo intestinal se determine mediante un
transductor de fuerza isometrico (TRIl 10, Letica, Espana), y la senal de voltaje generada se
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digitalizo a una frecuencia de muestreo de 20 Hz, usando una tarjeta de adquisicion A/D
(LabPC+, National Instruments, Austin, TX), para ser almacenados posteriormente en el
ordenador, gracias a un programa de analisis y adquisicion de datos (PHYSCAN) desarro-ilado
en nuestro laboratorio por uno de los autores (MD). Los datos fueron tlltrados a un
paso bajo de 5 Hz y analizados usando una serie de rutinas incluidas en el software de adqui-sicion.
Se uso de forma rutinaria el 20% del rango de actividad (20% RA) como referenda
en los distintos registros mostrados a lo largo del estudio.
2.5. Cotitractilidad Intestinal dependiente de Ctr'
En estos experimentos, los tejidos fueron primeramente incubados con PSS en ausen-cia
de Ca- , durante al menos 4 min. Cuando la serial alcanzo el estado estacionario se ana-dieron
volumenes pequeiios de CaCK ( 1 M) a la solucion del bano a la concentracion de cal-cio
deseada, mientras se registraba continuamente la tension isometrica que desarrollaba el
tejido. Con el fm de obtener las curvas dosis-respuesta para el calcio en estos tejidos, se
registraron las amplitudes maximas \ minimas de las contracciones a medida que se afiadian
concentraciones crecientes de CaCK.
2.6. Efectos de las poliaminas y el DFMO sobre la actividad contractu
El estudio sobre la actividad espontanea se realize en condiciones de registro conti-nue
para los distintos tramos intestinales incubados en PSS. Tras el correspondiente perio-do
de estabilizacion, se registro la actividad espontanea durante 10 min. Estos datos de acti-
\ idad fueron utilizados como control para la comparacion con las acti\ idades registradas
tras la exposicion a las diferentes drogas. Las distintas poliaminas (putrescina, espennidina
o espermina), o el DFMO, disueltos en H.O bidestilada, se anadieron directamente a la solu-cion
del bano mientras se registraba la actividad contractu.
Las drogas permanecieron en la solucion que bafiaba el tejido durante todo el expe-rimento.
No obstante, debido al rapido efecto que promueven estas sustancias sobre la mus-culatura
lisa intestinal, siempre fueron exposiciones cortas (pocos minutos). Cuando fue
necesario estudiar la reversibilidad del efecto, se procedio al lavado con PSS (al menos 3
veces) de la solucion del bano. Con el fm de registrar la actividad contractil peristaltica tipi-ca
de los distintos tramos intestinales se recupero el tejido durante un periodo de, al menos,
10 min.
En algunos experimentos, los efectos del KCl y BAY K8644 sobre tejidos relajados
con poliaminas se emplearon sobre la actividad contractil con la adicion de pequenos \ olu-menes
de la solucion stock directamente a la solucion del bano.
2. 7. Analisis matemdtico y estadistico
Las diferencias entre las medias muestrales se analizaron por analisis de varianza de
una via, ANOVA seguido del XQsXpost hoc de Tukey (se uso Kruskal-Wallis seguido del test
post hoc de Games-Howell cuando fue necesario) o el test de la t de Student-New man-
Keuls. Los valores conp < 0.05 fueron considerados signitlcativamente distintos. Los resul-tados
estan expresados como medias ± S.E.M. Las curvas dosis-respuesta se ajustaron a una
ecuacion logistica usando una herramienta de analisis de regresion lineal implementada en
el software SigmaPlot (Jandel Scientific, San Rafael, CA).
2.8. Drogas
Las distintas poliaminas (putrescina, espermidina y espermina), el BAY K8644 y el
EGTA se adquirieron en Biosigma (Espana). El DFMO se obtuvo de Bachem (Cymit
Quimica, Espana). Las distintas poliaminas y el DFMO fueron disueltos en H2O bidestila-da,
y guardadas como soluciones madre a -20 °C hasta su uso. El BAY K8644 fue disuelto
en dimetil sulfoxide (DMSO) y almacenado como solucion madre a -20 °C hasta su uso pos-terior.
La concentracion del solvente en el bailo nunca excedio el 0.1%.
3. RESULTADOS
3.1. Actividad espontdneay contracciones inducidas por CaCl2 en ileon y colon.
Los musculos lisos de ileon y colon presentaron tanto la actividad peristaltica
espontanea como el tono basal caracteristico de cada tramo intestinal. Ademas, ambas pro-piedades
fueron enteramente dependientes de la presencia de calcio en el medio extracelu-lar.
Asi, la ausencia de calcio en la solucion suprimio la actividad contractu caracteristica y
redujo el tono basal medio, causando una relajacion de la musculatura lisa intestinal (Fig.
2A-B, ileon y colon, respectivamente). La actividad espontanea no se vio afectada por la
adicion de volumenes maximos del vehiculo DMSO (Fig. 2C-D, ileon y colon, respectiva-mente)
o H2O bidestilada (datos no mostrados). La adicion acumulativa de Ca-^ a la solu-cion
del bano dio como resultado un incremento gradual de la actividad peristaltica esponta-nea,
asi como el aumento progresivo del tono basal de los tejidos (Fig. 2E-F, ileon y colon,
respectivamente). Los calculos realizados, ajustados a una funcion logistica no-lineal, mos-traron
que la EC50 (concentracion necesaria para desarrollar la mitad de la respuesta contrac-tu)
fue de 1.81 mM de CaCL para ileon y de 1.86 mM de CaCL para colon (Fig. 2E-F, ileon
y colon, respectivamente; paneles inferiores).
3.2. Efectos de las poliaminas y DFMO sobre la actividad contractu
Con el fm de explorar los efectos de las distintas poliaminas y del inhibidor compe-titive
de la ruta, la a-difluorometilomitina (DFMO), sobre el peristaltismo espontaneo del
tejido intestinal, se procedio a la exposicion de estas sustancias sobre tramos intestinales de
ileon y colon. Las tres poliaminas empleadas, putrescina, espermidina y espermina, carac-teristicas
de celulas animales de mamiferos, inhibieron la actividad peristaltica de ileon y
colon (Fig. 3A, ileon; Fig. 3D, colon). Asimismo, el inhibidor especifico de la principal
enzima de la ruta de las poliaminas (ODC), el DFMO, fue capaz de inhibir tambien la acti-vidad
peristaltica en un 92% y 94% para ileon y colon, respectivamente (Fig. 3B, ileon; Fig.
3E, colon). El DFMO se uso a la misma concentracion (5 mM) usada comunmente para
inhibir irreversiblemente la ODC tanto en extractos celulares como citosolicos (BORDA-LLO
et al, [2]; KOENIG et al, [10]). Las medidas del tono basal en respuesta a las incu-baciones
realizadas con las tres poliaminas y el DFMO revelaron una reduccion significati-va
que vario entre el 80% y el 92% comparada con los controles en el caso del ileon (Fig.
3C), y entre el 86% y el 98% en el caso del colon (Fig. 3F). El efecto inhibitorio observado
fue rapido (~ 10-30 segundos) tras la exposicion tisular a las distintas sustancias en el rango
milimolar. Las concentraciones estudiadas variaron dependiendo de la naturaleza policatio-
nica de la poliamina. Por ejemplo, para el caso de la teiramina espermina ( 1 mM) se alcan-zaron
efectos inhibitorios del 87% para ileon y del 98% para colon, obserxando una clara
inhibicion para concentraciones en el rango micromolar (500 mM) (datos no mostrados).
Asimismo, para la triamina espermidina la concentracion necesaria para inhibir la acti\ idad
contractu del colon en un 86% fue de I mM en la solucion del bano, mientras que para el
caso del ileon fue necesario incrementar la concentracion a 3 mM con el tin de obtener una
reduccion del 80%. Para la diamina putrescina se usaron concentraciones tlnales de 10 mM
con el fin de obtener reducciones del tono basal medio y de la acti\ idad contractu en un 90%
y 94% para ileon y colon, respecti\amente.
3.3. Reversihilidad del efecto de las poliaminas y el DFMO
Como se ha mostrado, las distintas poliaminas y el inhibidor DFMO fueron capaces
de inhibir la actividad peristaltica espontanea tanto en ileon como en colon de raton (panel
central de la Fig. 4A-D). Se observe que tras el lavado de estas sustancias con PSS (mini-mo
tres veces) y un periodo adicional de recuperacion de unos 10 min., los distintos tramos
intestinales recuperaron una actividad peristaltica espontanea similar a los periodos control
(paneles derechos de la Fig. 4A-D). Como se puede obser\ar para la diamina putrescina ( 10
mM) la eliminacion de la poliamina (Fig. 4A, ileon; Fig. 4C. colon) pemiitio recuperar la
actividad contractil sin que se observasen diferencias sustanciales ni en el peristaltismo ni
en el tono basal medio del tejido. Resultados similares se obtuvieron para el resto de polia-minas,
espermidina (3 mM) \ espermina ( 1 mM) en ambos tejidos (datos no mostrados). De
la misma manera el DFMO inhibio la actividad peristaltica intestinal y disminuyo el tono
basal medio de ambos tejidos. Los lavados con PSS y la eliminacion del inhibidor de la
solucion hizo, por una parte, reaparecer la actividad peristaltica espontanea (Fig. 4B, ileon);
Fig. 4D, colon) y, por otra parte, recuperar el tono basal medio en ambos tejidos. Si bien es
cierto que en el caso del ileon tanto la actividad peristaltica tras el lavado (previa exposicion
a DFMO) como del tono basal medio recuperado por el tejido fue ligeramente inferior a la
de sus controles. no se encontraron diferencias estadisticamente significativas al respecto.
Por todo ello, tanto las poliaminas como el DFMO demostraron tener efectos reversibles
sobre el efecto relajante producido en ileon \ colon de raton.
3.4. Efectos del KCl y BAYK8644 sobre los tejidos relajados con putrescina y DFMO
Con el fin de dilucidar el grado de interaccion que mantienen las poliaminas y el
DFMO con la celula muscular lisa aplicadas extracelularmente e indagar en el mecanismo
subyacente a la accion relajante sobre el musculo liso de ileon \ colon, se realizaron una
serie de experimentos con varios agentes quimicos de accion conocida sobre diversas con-ductancias
ionicas. Varios estudios han demostrado que las poliaminas tienen la capacidad
de alterar la excitabilidad membranaria por modulacion directa con detemiinados canales
ionicos, incluyendo los canales de K y de Ca- (FICKER et a!., [4]; GOMEZ & HELLS-TRAND
[6]; GOMEZ & HELLSTRAND [7]; SNETKOV et al, [26]; WILLIAMS [32]).
Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio sobre la musculatura lisa intestinal de
raton (DIAZ et al., [3]; MARRERO-ALONSO et al, [13]) sobre los canales de K . sugieren
que estos canales pudieran estar involucrados en el efecto relajante de las poliaminas y del
DFMO. Asi, un grupo de experimentos se orientaron a estudiar la adicion de 50 mM de KCl
sobre la musculatura lisa de ileon y colon previamente relajada con la poliamina (10 mM de
putrescina), o con el DFMO (5 mM) (datos no mostrados). Como se observa en la Fig. 5A
el ileon relajado con putrescina (10 mM) respondio a la despolarizacion por KCl (50 mM)
con un incremento transitorio de la tension isometrica. Resultados similares se obtuvieron en
preparaciones de colon (datos no mostrados), lo cual indica que los tejidos relajados con
poliaminas y DFMO preservan la capacidad de responder a la despolarizacion por KCl.
Con el objetivo de explorar los posibles efectos sobre los canales de Ca- , se uso a con-tinuacion
el agonista de los canales de Ca-" tipo L, BAY K8644, sobre la relajacion inducida
por las poliaminas sobre la musculatura intestinal. La aplicacion de BAY K8644 (1 mM) a
tejidos previamente relajados con putrescina promovio un incremento transitorio de la ten-sion
isometrica, seguida de una actividad peristaltica espontanea que fue muy parecida a la
de los tramos control para el caso del ileon (datos no mostrados), y menor en los tramos intes-tinales
de colon (Fig. 5B) incluso bajo la presencia continua de la poliamina. Finalmente, nos
propusimos estudiar los efectos del BAY K8644 y KCl anadidos secuencialmente, sobre ileon
y colon previamente relajados con DFMO (5 mM). La adicion del agonista BAY K8644 (1
)iM), promovio una respuesta contractu inmediata sobre la tension basal de ambos segmen-tos
intestinales y una recuperacion parcial de la actividad peristaltica espontanea para los tra-mos
intestinales de colon (Fig. 5C, panel derecho) siendo mas evidente en ileon (Fig. 5C,
panel izquierdo). La adicion consecutiva de 50 mM KCl sobre los tejidos previamente recu-perados
por BAY K8644 promovio en ambos tejidos el incremento transitorio caracteristico
de la tension isometrica en respuesta a la despolarizacion por KCl. Resultados similares se
obtuvieron con las tres poliaminas en ambos tejidos (datos no mostrados).
4. DISCUSION
Los datos que se presentan en este trabajo demuestran que las tres poliaminas que se
encuentran de forma natural en celulas animales (putrescina, espermidina y espermita), son
capaces de inhibir la actividad peristaltica espontanea, asi como el tono basal de la muscu-latura
lisa intestinal de ileon y colon de raton. De igual forma se observe que el inhibidor
competitive de la principal enzima de la ruta biosintetica de dichas poliaminas, el a-difluo-rometilornitina
(DFMO), ejerce los mismos efectos sobre la musculatura lisa intestinal, lo
cual se debe probablemente a la similitud estructural con las poliaminas naturales.
Se observe que la exposicion extracelular a las distintas poliaminas y al DFMO sobre
la musculatura lisa intestinal intacta promueve efectos relajantes rapidos (<30 s), efectos que
son reversibles ya que las actividades contractiles caracteristicas de estos tejidos fueron
recuperadas tras el lavado de las mismas. La rapidez de estos efectos junto al hecho de que
estas sustancias tienen una baja velocidad de transporte a traves de la membrana (saturables
en el rango micromolar) (SEILERN & DEZEURE [25]), hace suponer que los efectos pro-movidos
por las poliaminas, asi como por el DFMO, son ejercidos sobre la membrana
plasmatica sin la necesidad de que penetren al interior celular.
Numerosos trabajos ban demostrado que las poliaminas son causantes del bloqueo de
distintos grupos de canales ionicos en la membrana plasmatica (SCOTT et al, [23]; WEI-GER
et al, [31]; WILLIAMS [32]). Sin embargo, en todos ellos siempre se ha implicado a
dos de las tres poliaminas -espermina y en menor medida espermidina- que ban sido estu-diadas
en este trabajo. Si bien es cierto que la espermina y la espermidina tienen la capaci-dad
de ejercer los efectos relajantes anteriormente descritos, la diamina putrescina (la pri-mera
poliamina que es capaz de biosintetizar una celula animal) tambien es capaz de pro-
16
mover efectos inhibitorios equivalentes en el misino rango de concentraciones (10 mM).
Nuestros resultados demuestran que todas las poliaminas son capaces de inhibir la actividad
contractu intestinal observandose la siguiente secuencia en la potencia de la inhibicion:
espermina > espermidina > putrescina, lo que indica que la eficacia inhibitoria esta estre-chamente
relacionada con el numero de cargas positivas distribuidas en la superficie de la
molecula conformacionalmente flexible (SCHUBER [22]; WEIGER et ai, [31]). Esta rela-cion
interesante sugiere que la naturaleza cationica de estas sustancias es clave en el grado
de interaccion electroestatica que mantienen con los lugares de accion, y es por tanto deter-minante
del efecto inhibitorio.
La ODC (ornitina descarboxilasa), la primera enzima de la ruta biosintetica de las
poliaminas en celulas animales, cuenta con un inhibidor competitivo estructuralmente rela-cionado
con las poliaminas, el DFMO (METCALF et ai, [16]), que la inhibe irreversible-mente.
El DFMO ha sido muy estudiado > usado con diversos fines, desde la investigacion
basica, hasta el uso simple o combinado en tratamientos contra el cancer. Dado que los ni\ e-les
de las poliaminas pueden ser manipulados farmacologicamente y pueden proporcionar
informacion sobre las dianas implicadas en el mecanismo de accion, es concebible pensar
que la alteracion de los sistemas de poliaminas proporcione informacion sobre la interaccion
que puedan llegar a establecer con canales ionicos. De esta manera, demostramos en este
estudio que el DFMO no solo promueve efectos inhibitorios sobre la actividad contractu del
ileon y colon, sino que estos ocurren a concentraciones (5 mM) usualmente empleadas para
inhibir la ODC en extractos celulares \/o citosolicos. El DFMO es capaz de mimetizar el
efecto relajante en el mismo rango de concentraciones y en el mismo intervalo de tiempo que
las tres poliaminas ensayadas, siendo el efecto totalmente revertido tras el la\ ado (Fig. 4).
Se sabe que el origen y la propagacion de la excitacion del musculo liso gastrointes-tinal
es consecuencia de la actividad electrica ritmica, causante de la contractilidad del mus-culo
liso intestinal de forma sincronica (SZURSZEWSKI [29]). Las fases de despolariza-cion-
repolarizacion de las ondas lentas de las musculatura lisa intestinal refiejan un balance
entre la actividad dependiente de voltaje de los canales de Ca-" (VSCC) y los canales de K'
activados por Ca-* (LEE et al, [H])- Por lo tanto, el hecho de que la maquinaria contractil
del ileon y colon fuese funcional despues de la exposicion a las distintas poliaminas y al
DFMO hizo que nuestros experimentos se centraran en la posible interaccion de estas sus-tancias
con dianas moleculares en la membrana plasmatica. En este sentido, se ha demos-trado
en celulas musculares lisas de arteria pulmonar de conejo (SNETKOV et al, [26]) que
las poliaminas, en el rango milimolar, pueden actuar sobre los canales de K^ activados por
Ca-' (SNETKOV et al, [26]). De igual forma, la espermina y la espermidina tienen la capa-cidad
de intervenir en la apertura intrinseca de ROMKl, un canal rectificador debil hacia
dentro sensible a ATP (FICKER et al, [4]), y que la espermina a bajas concentraciones es
capaz de disparar de forma intrinseca los canales de K rectificadores hacia dentro (FICKER
et al, [4]; LOPATIN et al, [12]). Asimismo, se sabe que tanto el bloqueo de los canales de
K* como la despolarizacion con altas concentraciones de potasio en el medio extracelular
son causantes del incremento de la fuerza contractil generada por el musculo gastrointesti-nal
(MEISS [15]). Teniendo en cuenta que las poliaminas se transportan muy lentamente a
traves de la membrana plasmatica (SEILERN & DEZEURE [25]) y que los efectos descri-tos
en este estudio transcurren en pocos segundos (al igual que para el DFMO), nos plante-amos
buscar posibles interacciones de estas moleculas sobre la superficie celular.
La hipotesis que proponemos para el efecto relajante de las poliaminas y el DFMO
esta relacionada con las fases de despolarizacion-repolarizacion de las ondas electricas len-
17
tas de la musculatura lisa intestinal. Debido a que las poliaminas se han relacionado directa-mente
con la modulacion de las corrientes rectificadoras de los canales de K" (FICKER etal,
[4]; LOPATIN et al, [12]) estudiamos la respuesta a la despolarizacion por KCl (50 mM).
Observamos que la despolarizacion de los tejidos relajados con poliaminas y DFMO causa
una contraccion transitoria seguida de una inactivacion reversible de la actividad contractu.
Si bien es cierto que no podemos confirmar una modulacion completa del canal de K por
estas sustancias, el hecho de que las altas concentraciones de poliamina, putrescina (10 mM)
y DFMO (5 mM) usadas en estos experimentos no supriman por completo la respuesta a la
despolarizacion por KCl (50 mM) nos sugiere que las poliaminas relajan el musculo liso
intestinal de ileon y de colon por hiperpolarizacion de la celula muscular lisa a traves de la
alteracion de las conductancias al K^, los cuales juegan un papel importante en la regulacion
de la excitabilidad del sincitio gastrointestinal (VOGALIS [30]). Por lo tanto, la modulacion
de la actividad de los canales de K^ por poliaminas podria disparar una corriente de salida
que, eventualmente, podria desplazar el potencial de reposo de la membrana hacia valores
mas negativos resultando en una hiperpolarizacion de la celula muscular lisa.
Nuestros resultados muestran asi mismo que la inhibicion inducida tanto por la dia-mina
putrescina como por el DFMO sobre la actividad contractu de ileon y colon pudo ser
parcialmente revertida por la aplicacion del BAY K8644, agonista de canales de Ca-^ tipo L.
De hecho, la aplicacion del derivado dihidropiridinico restauro, al menos parcialmente, la
actividad peristaltica espontanea e incremento el tono basal de los tejidos previamente rela-jados
con putrescina y DFMO. Este hecho apunta a una modulacion negativa de los canales
de Ca-^ tipo L por parte de las poliaminas.
En efecto, este estudio demuestra que existe una relacion del grado de aminacion de
la molecula (y por tanto de cargas positivas sobre su superficie) con la concentracion a la
cual se produce la inhibicion de la actividad peristahica espontanea de la musculatura lisa
intestinal tanto de ileon como de colon. Ademas, en el musculo liso intestinal, la inhibicion
de los canales de Ca-^ tipo L implica una caida del tono basal y la desaparicion de la activi-dad
espontanea. Esto es debido principalmente a que estas proteinas son las que suministran
la mayor fuente de entrada de Ca-" desde el espacio extracelular, y son responsables de la
actividad ritmica gastrointestinal. Nuestros resultados demuestran que los canales de Ca'^
quedarian regulados negativamente tanto por poliaminas como por DFMO. Estos resultados
sugieren que estas sustancias inhiben la actividad peristaltica del musculo liso intestinal por
inhibicion de las corrientes de Ca-* a traves de canales tipo L en la celula muscular. Los
mecanismos por los cuales las poliaminas interactuan con los canales de Ca-^ no estan cla-ros,
si bien se ha sugerido la union directa al poro del canal o con los sitios de regulacion
(SCOTT et al, [23]). Estos resultados estan de acuerdo con los previamente descritos
(GOMEZ & HELLSTRAND [6]), donde la espermina 1 mM consigue inhibir las corrientes
restauradas por la dihidropiridina BAY K8644.
A raiz de estos hallazgos, proponemos que tanto las poliaminas naturales, como el
DFMO, son capaces de activar las conductancias de los canales de K^ dependientes de vol-taje
conduciendo a la celula muscular lisa a una pequena hiperpolarizacion que seria sufi-ciente
para mantener los canales de Ca^^ dependientes de voltaje lejos de su umbral de acti-vacion.
La reduccion de la entrada de Ca'^ de forma ritmica al interior celular, junto con la
reduccion del potencial de membrana, tenderia a mantener los canales de K^ en un estado
conformacionalmente cerrado. Cuando los canales de Ca- dependientes de voltaje son obli-gados
a abrirse por la presencia del agonista dihidropiridina (BAY K8644), el efecto dual de
la entrada masiva de calcio al interior celular asi como el estado del potencial de membra-
na, podria disparar la activacion de los canales de K de alta conductancia. Esio promoveria
un flujo de K hacia el exterior que, conjuntamente con los canales de K* dependientes de
voltaje, iniciaria una rapida hiperpolarizacion de la celula muscular lisa, causando la oscila-cion
ritmica y rapida de la actividad contractil en presencia del BAY K8644 tanto en ileon
como en colon. Por lo tanto, la inhibicion macroscopica rapida de la actividad contractil
seria consecuencia por un lado de la activacion de canales de K" y la inhibicion de canales
de Ca-' tipo L en la membrana plasmatica de celulas musculares lisas intestinales.
Las altas concentraciones de poliaminas (mM) necesarias para producir el efecto rela-jante
del musculo intestinal sugieren que el efecto es mas farmacologico que fisiologico. En
consecuencia, el uso terapeutico de determinados analogos de las poliaminas que actualmen-te
son usados para los tratamientos de la hipermotilidad intestinal (BERGERON et ai, [1]),
bien podrian englobar la inhibicion de la activ idad del canal de Ca- , asi como la modulacion
positiva del canal de K , como se sugiere en este estudio para la putrescina y el DFMO.
5. CONCLUSIONES
Este trabajo demuestra por primera vez que la diamina putrescina, asi como el inhi-bidor
que bloquea la enzima responsable de su sintesis, el DFMO, promueven efectos inhi-bitorios
agudos sobre la actividad lisa gastrointestinal.
Los resultados sugieren que el efecto es extracelular > directo. y no se deben a una
accion desde el lado intracelular resultante del transporte transmembranario de las poliami-nas
hacia el interior celular.
La espermina es un inhibidor mucho mas potente que la espermidina y que la putres-cina.
Esta observacion sugiere que el numero de cargas positivas de las poliaminas deter-mina
el tipo de interacciones electroestaticas sobre los canales ionicos, de forma que la
potencia inhibitoria presenta una relacion estructura-actividad que sigue la secuencia: esper-mina
> espermidina > putrescina.
Tanto la putrescina como el DFMO parecen actuar a traves de un mecanismo comun
que involucraria, por un lado, la modulacion positiva de la conductancia de los canales de
K' y, por otro, la inhibicion de los canales de Ca" tipo L de la membrana plasmatica, indu-ciendo
una relajacion de la musculatura lisa intestinal de ileon > colon.
6. AGR.\DECIMIENTOS
Financiado por los proyectos PI042460 (ISCIII, FISS), PI0422005/041 (Gobiemo de
Canarias) y SAF2007-66148-C02-02 (Ministerio de Educacion y Ciencia). JMA es becario
del subprograma de Formacion de Personal Universitario (FPU) del Ministerio de
Educacion y Ciencia. Agradecemos a Rafael Robayna y Alicia Sacramento (Universidad de
las Palmas de gran Canaria) su colaboracion en los ensa> os de poliaminas.
7. BIBLIOGRAFiA
[1] BERGERON. R.J., GW. YAO, H. YAO, W.R. W E1NL\R. CA. SNFNSKY. B. R.\IS-LER,
Y. FENa Q. WU, & F. GAO. 1996. Metabolically programmed polyamine ana-logue
antidiarrheals. Journal of Medicinal Chemistr>. 39(13): 2461 -247 L
19
[2] BORDALLO, C, J.M. RUBIN, A.B. VARONA, B. CANTABRANA, A. HIDALGO,
& M. SANCHEZ. 2001. Increases in ornithine decarboxylase activity in the positive
inotropism induced by androgens in isolated left atrium of the rat. European Journal of
Pharmacology. 422(1-3): 101-107.
[3] DIAZ, M., CM. RAMIREZ, R. MARIN, J. MARRERO-ALONSO, T. GOMEZ, & R.
ALONSO. 2004. Acute relaxation of mouse duodenun by estrogens: evidence for an
estrogen receptor-independent modulation of muscle excitability. European Journal of
Pharmacology. 501(1-3): 161-178.
[4] PICKER, E., M. TAGLIALATELA, B. WIBLE, C. HENLEY, & A. BROWN. 1994.
Spermine and spermidine as gating molecules for inward rectifier K^ channels. Science.
266(5187): 1068-1072.
[5] GERNER, E.W. & F.L. MEYSKENS. 2004. Polyamines and cancer: old molecules,
new understanding. Nature Reviews Cancer. 4(10): 781-792.
[6] GOMEZ, M. & R HELLSTRAND. 1995. Effects of polyamines on voltage-activated
calcium channels in guinea-pig intestinal smooth muscle. Pfliigers Archiv European
Journal of Physiology. 430(4): 501-507.
[7] GOMEZ, M. & R HELLSTRAND. 1999. Endogenous polyamines modulate Ca-"
channel activity in guinea-pig intestinal smooth muscle. Pfliigers Archiv European
Journal of Physiology. 438(4): 445-451.
[8] GONZALEZ-MONTELONGO, M.C., R. MARIN, T. GOMEZ, & M. DIAZ. 2006.
Androgens differentially potentiate mouse intestinal smooth muscle by non-genomic
activation of polyamine synthesis and Rho-kinase activation. Endocrinology. 147(12):
5715-5729.
[9] HEBY, O. 1981. Role of polyamines in the control of cell proliferation and differen-tiation.
Differentiation. 19(1): 1-20.
[10] KOENIG, H., A.D. GOLDSTONE, & C.Y LU. 1988. Polyamines are intracellular
messengers in the b-adrenergic regulation of Ca'^ fluxes, [Ca-^]j and membrane trans-port
in rat heart myocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications.
153(3): 1179-1185.
[11] LEE, J.C.F., L. THUNEBERG, I. BEREZIN, & J.D. HUIZINGA. 1999. Generation of
slow waves in membrane potential is an intrinsic property of interstitial cells of Cajal.
American Journal Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 277(2): G409-
G423.
[12] LOPATIN, A.N., E.N. MAKHINA, & C.G NICHOLS. 1994. Potassium channel block
by cytoplasmic polyamines as the mechanism of intrinsic rectification. Nature.
372(6504): 366-369.
[13] MARRERO-ALONSO, J., B. GARCIA MARRERO, T. GOMEZ, & M. DIAZ. 2006.
Functional inhibition of intestinal and uterine muscles by non-permeant triphenylethy-lene
derivatives. European Journal of Pharmacology. 532(1-2): 115-127.
[14] MARUTA, K., Y. MIZOGUCHI, & T. OSA. 1985. Effects of polyamines on the
mechanical and electrical activities of the isolated circular muscle of rat uterus.
Japanese Journal of Physiology. 35(6): 903-915.
20
[15] MEISS, R.A. 1987. Mechanical properties of gastrointestinal smooth muscle. In:
Johson, L.R. (Ed.), Physiology of the Gastrointestinal Tract. Raven Press. 273-329.
[16] METCALF, B.W., R BEY, M.J. DANZIN, M.J. JUNG R CASARA. & J.R VEVERT.
1978. Catalytic irreversible inhibition of mammalian ornithine decarbo.xylase (E.C.
4.1.1.17) by substrate and product analogues. Journal of the .American Chemical
Society. 100: 2551-2553.
[17] NILSSON, B.O., M. GOMEZ, R. SANTIAGO CARRILHO, I. NORDSTROM, & R
HELLSTRAND. 1995. Differential actions of exogenous and intracellular spermine on
contractile activit\ in smooth muscle of rat portal \ein. .Acta Physiologica
Scandinavica. 154(3): 355-365.
[18] NILSSON, B.O. & R HELLSTRAND. 1993. Effects of polyamines on intracellular
calcium and mechanical activit> in smooth muscle of guinea-pig taenia coli. Acta
Physiologica Scandinavica. 148(1): 37-43.
[19] PALADE, P. 1987. Drug-induced Ca-' release from isolated sarcoplasmic reticulum.
III. Block of Ca- -induced Ca- release by organic pol\ amines. Journal of Biological
Chemistr\. 262(13): 6149-6154.
[20] PEGG, A.E. 1986. Recent advances in the biochemistr\' of pohamines in eukar\otes.
Biochemical Journal. 234(2): 249-262.
[21] PEGCi, A.E. & RR MCCANN. 1982. Polyamine metabolism and function. American
Journal of Physiology - Cell Physiology. 243(5): C212-C221.
[22] SCHUBER, F. 1989. Influence of pohamines on membrane functions. Biochemical
Journal. 260(1): 1-10.
[23] SCOTT, R.H., K.G SUTTON, & A.C. DOLPHIN. 1993. Interactions of polyamines
with neuronal ion channels. Trends in Neurosciences. 16(4): 153-160.
[24] SEILER. N.. F. BOLKENIUS, & O. RENNERT. 1981. Interconversion, catabolism and
elimination of the polyamines. Medical Biology. 59(5-6): 334-346.
[25] SEILERN, N. & F. DEZEURE. 1990. Polyamine transport in mammalian cells.
International Journal of Biochemistry. 22(3): 211-218.
[26] SNETKOV, V.A., A.M. GURNEY, J.R WARD, & O.N. OSIPENKO. 1996. Inward rec-tification
of the large conductance potassium channel in smooth muscle cells from rab-bit
pulmonar} arteiy. Experimental Physiology. 81(5): 743-753.
[27] SWARD, K., B.O. NILSSON, & R HELLSTR.AND. 1994. Polyamines increase Ca-"
sensitivity in permeabilized smooth muscle of guinea pig ileum. American Journal of
Physiology - Cell Physiology. 266(6): C1754-cl763.
[28] SWARD, K., M.D. PATO, B.O. NILSSON, I. NORDSTROM, & R HELLSTR.\ND.
1995. Pohamines inhibit myosin phosphatase and increase LC20 phosphorylation and
force in smooth muscle. American Journal of Physiolog> - Cell Physiology. 269(3):
C563-C571.
[29] SZURSZEWSKI, J.H. 1987. Electrophysiological basis of gastrointestinal motility. In:
Johnson, L.R. (Ed.), Physiology of the Gastrointestinal Tract. Raven Press, New York.
383-422.
[30] VOGALIS. F. 2000. Potassium channels in gastrointestinal smooth muscle. Journal of
Autonomic Pharmacology. 20(4): 207-219.
21
[31] WEIGER, T.M., T. LANGER, & A. HERMANN. 1998. External action of di- and pol-yamines
on maxi calcium-activated potassium channels: an electrophysiological and
molecular modeling study. Biophysical Journal. 74(2): 722-730.
[32] WILLIAMS, K. 1997. Interactions of polyamines with ion channels. Biochemical
Journal. 325(2): 289-297.
22
FIG. 1
tArginina
Cicio de la urea I
I
DFMO
CO
Putrescina
H,N
\
N^-Acetilespermidina
SAMDC Espermidina
N\N^2.DJacetilespermina
Espermina
H,N
Figura 1. Metabolismo de las poliaminas en celulas animales. El metabolismo de la arginina. que precede del
ciclo de la urea a traves de la accion de la arginasa. promueve la formacion de omitina. La omitina es descarboxi-lada
para producir putrescina y CO^ por accion de la omitina descarboxilasa (ODC; EC 4.1.1.17). La espermidina
y espermina son sintetizadas posteriormente en dos reacciones consecutivas llevadas a cabo por la espermidina
(SRM; EC 2.5.1.16) y espermina sintasas (SMS; EC 2.5.1.22), respectivamente; con la incorporacion de un primer
y segundo grupo aminopropilico (APG), provenientes de la descarboxilacion de la S-adenosilmetionina (SAM)
para generar S-adenosilmetionina descarboxilada (SAMdc) (donante de APG) por la accion del la S-adenosilme-tionina
descarboxilasa (SAMDC; EC 4.1.1.50) y la liberacion final de 5'-metiltioadenosina (MTA). Si bien es cier-to
que estas dos ultimas reacciones son irreversibles, la espermina puede ser convertida a espermidina, y esta a
putrescina, por la accion de la espermidina espermina N -acetiltransferasa (SSAT) tratandose de una propilamino-acetil
transferasa que monoacetila espermidina y que puede mono- o diacetilar espermina.
23
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24
(A)
IP^F^^ SPD [3 mM ] I
|PUTI10mM]| i'Tr ^^ I SPM [1 mM 1 I
(B) (C)
IhiHniiiiiAill Mill kitiki
OFMO [5 mM ]
50
40
<
Qi 30
20
10
r^
m
(D)
t\ ! PUT[10mM] 1
sL— § SPM [1 mM ]
(E) (F) 70-,
AAf^A^^^^ s
S imin
DFMO [5 mM ]
40
30 -
20-
10
i
Figura 3. Relajacion de la musculatura lisa intestinal de ileon y colon per poliaminas y DFMO. Trazados
representatives de los efectos relajantes promovidos por las distintas poliaminas [putrescina (Put), espermidina
(Spd) y espermina (Spm)] y del a-difluorometilomitina (DFMO) sobre el tono basal de la actividad contractu
espontanea de ileon (A-C) y colon (D-F), respectivamente. La putrescina se afiadio a concentraciones finales de 10
mM (n = 9) con el fin de obtener un efecto relajante completo. Resultados similares se obtuvieron para la esper-mina
a 1 mM (n = 7) y DFMO a 5 mM (n = 5), tanto en ileon como en colon. La espermidina se ensayo a 3 mM
(n = 7) y 1 mM (n = 9) en ileon y colon, respectivamente. Los graficos (C,F) muestran el efecto de las distintas
poliaminas y DFMO sobre el tono basal medio de los tejidos. Los resultados estan expresados como medias ±
S.E.M. de, al menos. 5 preparaciones diferentes en ileon y 3 en colon. *** Estadisticamente diferentes de los con-troles
con una probabilidad de /'<0.005.
25
(A) PUT [ 10 mM ]
70 -]
-
1 1 hr; !
/ /^ J"
(B) ] [ DFMO [ 5 mM ] ]
60
50,0-
] g 40,0.
-1
.v.°' <.*^ ..«"
(C)
^^AM^fM*H#
PUT[10mM] 1
VjWll#\jwv^\^
70-
60- T T
^ - n I S5 30-
2°
10- ******
-| I I r—i W
—
^"^ > JP
(D)
V^Y-""^
DFM0[5mM] Lavado
|
pT^Jr-M^
< 50 -
'4
o^L
i
Figura 4. Reversibilidad del efecto relajante promovido por la poliamina y DFMO en ileon y colon. El efec-to
inhibitorio de las poliaminas (se muestra el efecto relajante de 10 mM de putrescina, PUT) y de 5 mM de DFMO
son reversibles, tanto en ileon (A,B) como en colon (C,D), observandose una recuperacion del tono basal y la acti-vidad
peristaltica despues de los lavados. Los trazados correspondientes a ios lavados se obtuvieron transcurridos
10 min., despues de reemplazar la solucion que contenia la putrescina o el DFMO en la solucion del bano. Todos
los registros fueron obtenidos de la misma preparacion que la del periodo control (panel izquierdo), el tratamiento
con putrescina o DFMO en el bailo (panel central) y tras varios minutos despues del lavado (panel derecho) de cada
experimento realizado. Los diagramas de barras recogen las comparaciones entre las medias de las tensiones isome-tricas
en respuesta al efecto relajante de las moleculas. Los trazados son representativos de, al menos, 5 experi-mentos
diferentes. Los resultados estan expresados como medias ± S.E.M. *** Estadisticamente diferentes de los
registros control con una probabilidad de P<0.005.
26
(A)
Mli|iUi>^
Put
(B)
KCI
I
(C)
iWJ^Wj^
DFMO klLA\^\
V'^^-^-J^^^
BAYK DFMO
KCI BAYK 1
KCI
Figura 5. Efectos del KCI y BAY K8644 sobre los tejidos relajados con poliamina o DFMO. (A) Efecto del
KCI (50 mM) sobre el musculo ileal previamente relajado con poliamina (se muestra el efecto de 10 mM de putres-cina,
PUT). (B) Efecto de 1 mM de BAY K8644 sobre el tejido colonico previamente relajado con poliamina (se
muestra el efecto de 10 mM de putrescina. PUT). (C, D) Efectos de la adicion secuencial de 1 mM de B.AY-K8644
y 50 mM de KCI sobre tejidos musculares de ileon (C) y colon (D) relajados con 5 mM de DFMO. Uos registros
son representativos de tres experimentos diferentes.
27