Caracterización del receptor de estrógenos tipo alfa (REa) asociado a la membrana plasmática de neuronas septales hipocampales

              Rev. Acad. Canar. Cienc, XVIII (Num. 4), 9-19 (2006) (publicado en agosto de 2007)
CARACTERIZACION DEL RECEPTOR DE ESTROGENOS TIPO
ALFA (REa) ASOCIADO A LA MEMBRANA PLASMATICA DE
NEURONAS SEPTALES HIPOCAMPALES
C. M. Ramirez'*, M. C. Gonzalez-Montelongo-, J. Marrero-Alonso-, M. Gonzalez',
M. L. Barreiro', A. Cabrera-Socorro\ M. Diaz- & R. Marin'
Departamento de Fisiologia, Facultad de Medicina
- Departamento de Biologia Animal, Facultad de Biologia
Departamento de Anatomia, Facultad de Medicina
Universidad de La Laguna. Tenerife, Islas Canarias
* cramirez@ull.es
RESUMEN
Numerosas evidencias de estudios tanto in vivo como in vitro demuestran el papel de
los estrogenos en el desarrollo y la preservacion del sistema nervioso central. A pesar de que
los mecanismos de accion estrogenicos clasicos o genomicos son bien conocidos, cada vez
se describen mas acciones estrogenicas altemativas particulamiente relevantes en el feno-meno
de la neuroproteccion. En estos procesos parecen estar implicados receptores de estro-geno
de membrana, cuya identidad molecular permanece aun por dilucidar. Con el fm de
investigar la estructura molecular de estos receptores de membrana. hemos analizado por
western-blot una bateria de anticuerpos dirigidos contra diferentes regiones del receptor
nuclear tipo alfa, en fracciones de membrana plasmatica de dos lineas neuronales de septum
(SN56) e hipocampo de raton (HT22). Ademas, dado que la glicosilacion podria ser una
modificacion post-traduccional en los receptores de estrogenos (RE), hemos explorado esta
posibilidad como posible factor determinante de la existencia de diferentes formas molecu-lares
del receptor de estrogenos en la membrana plasmatica. Nuestros resultados demues-tran,
en ambas lineas celulares, la existencia de una alta homologia estructural entre las for-mas
nucleares y de membrana de los RE tipo alfa (REa), asi como la existencia de patrones
de O-glicosilacion en la isoforma membranaria de 80 KDa.
Palabras Clave: Receptores de estrogenos de membrana, glicosilacion, mapeo de
epitopes.
ABSTR.4CT
E\idences from in vivo and in vitro studies have demonstrated the role of estrogens
in the development and preservation of the central nervous system. In addition to the well-known
classical or genomic mechanisms of actions of estrogens, evidences accumulated in
recent years have substantiated the existence of alternati\e mechanisms of actions for these
hormones, which appear to be particularly relevant in the phenomenon of neuroprotection.
Interestingly, these alternative actions are mediated by membrane estrogen receptors whose
molecular identities are not well understood. In order to investigate the molecular features
of these membrane located estrogen receptors, we have used several antibodies directed to
different regions of the nuclear estrogen receptor (ER) to analyse by western blot the puri-fied
plasma membrane proteins of septum-derived SN56 and hippocampal-derived HT22
cell lines. Furthermore, taking into account that glycosylation may be a post-traductional
modification accounting for the observed different estrogen receptors molecular weights, we
have explored here the putative glycosylation of membrane ER isoforms. Our results
demonstrate, in both cell lines, the existence of a high degree of structural homology bet-ween
nuclear and membrane ER counterparts, as well as a clear O-glycosylation pattern in
the 80 kDa membrane isoform.
Keywords: membrane estrogen receptors, glycosylation, epitope mapping.
1. INTRODUCCION
Tradicionalmente, se sabe que los estrogenos ejercen sus acciones mediante la union
y activacion de los receptores de estrogenos (RE) de los que se conocen dos subtipos (a y
p). Estos actuan como factores de transcripcion en el nucleo modulando la expresion de cier-tos
genes (BEATO [2]) que, en el caso concreto de la neuroproteccion, pueden estar rela-cionados
con la supervivencia neuronal (PIKE [21]; SINGER et al, [23]; DUBAL et al.,
[7]). El efecto neuroprotector de los estrogenos se ha demostrado en modelos animales que
reproducen paradigmas experimentales de esta enfermedad (revisado en GARCIA-SEGU-RA
et al, [8]) y en un gran numero de cultivos neuronales y lineas neuronales inmortaliza-das
expuestas a diferentes factores neurotoxicos, tales como la toxicidad inducida por el
peptido beta amiloide (PA) (MARIN et al, [11]) considerado como uno de los principales
factores neurotoxicos de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, en las dos ultimas deca-das
se ha puesto de manifiesto la existencia de receptores de localizacion extranuclear, prin-cipalmente
asociados a la membrana plasmatica por mecanismos aun desconocidos tenien-do
en cuenta su estructura carente de dominios hidrofobicos, y que podria implicar a otras
proteinas asociadas o bien modificaciones post-traduccionales que permitieran su insercion
en la membrana plasmatica. De manera interesante, estos receptores parecen estar implica-dos
en los mecanismos "no genomicos o alternativos" de los estrogenos, en los que la union
de la hormona produce una serial intracelular rapida (independiente de la transcripcion geni-ca)
mediante la activacion de cascadas de senalizacion intracelulares (revisado en NADAL
etal, [18]).
En la actualidad parece dificil encontrar una zona del cerebro ajena a las acciones de
los estrogenos (McEWEN [17]) y, mas interesante aun, una parte importante de estas accio-nes
parecen ser ejercidas a traves de mecanismos alternativos o rapidos que se iniciarian en
la membrana plasmatica (WEAVER et al, [26]; SINGER et al., [23]; NORFLEET et al.,
[19]). Se han descrito lugares de union a estradiol en la membrana plasmatica de muchas
regiones del cerebro (ZHENG & RAMIREZ [27]), algunas de las cuales son afectadas en
procesos degenenerativos (BEYER et al., [3]), asi como en cultivos celulares de septum e
hipocampo (MARIN et al.,[\2]; CLARKE et al., [6]). Aunque poco se conoce todavia sobre
la identidad molecular de estos receptores de membrana, todo apunta a que pueden ser dis-tintas
isoformas de la misma proteina.
En nuestros laboratories, hemos identificado en los ultimos anos la existencia de
receptores de estrogenos asociados a la membrana en dos lineas neuronales derivadas de
10
hipocampo (HT22) y de septum (SN56) de raton. En el caso de esta ultima, nuestro grupo
de investigacion ha demostrado por primera \ez la participacion de un RE de membrana
(REm) en la neuroproteccion ejercida por estradiol frente a una toxicidad inducida por el
peptido amiloide (MARIN et ai, [12]). Mediante tecnicas inmunoquimicas. hemos demos-trado
la presencia de un RE de tipo alfa con el mismo tamano que el nuclear (67kDa) en la
membrana plasmatica de las dos lineas celulares, ademas de una forma de ma\or peso
molecular (80kDa), cuya naturaleza esta aun por explorar.
Con el tin de caracterizar estas proteinas asociadas a la membrana neuronal, hemos
realizado un mapa de epitopos basado en su inmunoreactividad a anticuerpos especificos
dirigidos contra diferentes regiones de la estructura del REa nuclear clasico, obteniendo una
valiosa informacion acerca del grado de homologia existente entre las formas de membrana
con respecto al receptor nuclear clasico. Por ultimo, dado que ha sido previamente demos-trada
la existencia de subpoblaciones celulares del RE nuclear clasico con modificaciones
post-traduccionales por glicosilacion de la proteina nativa (CHEN & HART [5]), lo que
parece estar relacionado con la modulacion funcional de la misma, hemos explorado esta
posibilidad para el caso de los receptores de membrana presentes en ambos modelos celu-lares
(SN56 y HT22).
2. MATERIAL Y METODOS
2.1 Cultivos celulares
Las lineas celulares SN56 y HT22 se cultivaron en medio DMEM {Dulbecco's
Modified Eagle's Medium) con Suero Bovino Fetal al 10 %, 4.5 g/1 de Glucosa, 3.7 g/1 de
NaHC03, 61 mg/1 de Penicilina G y 100 mg/1 de Sulfato de Estreptomicina (pH= 7.4), a una
temperatura de 37 °C en una atmosfera que contenia 5 % C02-95% aire. Cuando se alcanza-ron
niveles de confluencia del 70-80%, las celulas se disociaron con tripsina (0.25 %) y se
sembraron en placas Petri de 35 x 10 mm o 60 x 15 mm para los diferentes experimentos.
2.2 Extraccion de proteinas de la membrana plasmatica a partir de las lineas
neuronales
Las membranas plasmaticas de las lineas celulares fueron aisladas usando la tecnica
de la silice coloidal cationica (CHANEY & JACOBSON [4]), la cual permite la obtencion
de fracciones purificadas con un 80-90% de proteinas de este dominio celular. El grado de
pureza de las fracciones de membrana se establecio mediante tecnicas de western blot, uti-lizando
por una parte un anticuerpo especifico dirigido contra la proteina Hsp90 (citosoli-ca),
y por otra parte un anticuerpo contra la subunidad al de la Na^/K'-ATPasa (localizada
exclusivamente en la membrana plasmatica) (MARIN et al., [14]).
2.3 Western blot
Los extractos proteicos (totales y de membrana plasmatica) obtenidos a partir de las
lineas celulares SN56 y HT22 se resolvieron en geles de poliacrilamida al 10 %, y se trans-firieron
electroforeticamente a membranas de polivinilo (PVDF). Estas membranas fueron
incubadas durante toda la noche a 4°C con el anticuerpo primario contra el REa (Ver tabla
1) diluido en BLOTTO {Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer), es decir, una solucion
de leche en polvo desnatada disuelta en PBS {Phosphate Buffered Saline) al 5%.
Posteriormente se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo secundario acoplado a
11
Anticuerpo anti-REa Dominio Proveedor Comercial Dilucion utilizada
ER21 Amino-terminal
Cedido por el
Dr. Geoffrey L. Green
Universidad de Chicago,
Estados Unidos
3 ^g/|al
H184 (A/B) Union ADN Sta. Cruz Biotechnology 1:200
H151 (D) Bisagra Stressgen 1:150
AblO (E) Union hormona Neomarkers 5 ^ig/^l
MC20 C-terminal Sta. Cruz Biotechnology 1:200
Tabia 1. Informacion de interes sobre los anticuerpos anti-REa utilizados.
Peroxidasa de Rabano (HRP). Las bandas inmunoreactivas se visualizaron mediante qui-mioluminiscencia
utilizando el sistema comercial "ECL plus" de Amersham. Los extractos
totales de la linea celular de cancer de mama humano (MCF-7), se utilizaron en algunos
casos como control positivo de los western blot con anticuerpos contra el REa.
2.4 Ensayos de inmunoprecipitacion
Los extractos proteicos procedentes de las dos lineas neuronales SN56 y HT22 se
incubaron con agitacion durante 1 bora a 4°C con un exceso del anticuerpo dirigido contra
el RE . A continuacion, los inmunocomplejos fueron adsorbidos por esferas magneticas
(Dynabeads®). Las proteinas inmunoprecipitadas fueron extraidas del complejo formado
por elucion en el tampon de carga de electroforesis en condiciones desnaturalizantes o SDS-PAGE
(625 mM Tris-HCl, 1% duodecil sulfato de sodio, 10% glicerol, 5% P-mercaptoeta-nol
y 0.001% de azul de bromofenol, pH 6.8), calentando a 99°C durante 5 minutos. Las pro-teinas
inmunoprecipitadas se procesaron y analizaron posteriormente por western-blot.
2.5 Deteccion de glicoproteinas y deglicosilacion
Para la deteccion de proteinas glicosiladas en las dos lineas celulares se utilize el sis-tema
comercial "Glycoprotein Detection Kit" de Amersham. Los extractos proteicos totales
y de membrana plasmatica se resolvieron y transfirieron electroforeticamente a membranas
de PVDF. Las proteinas inmovilizadas en membranas de PVDF se trataron con 10 mM de
metaperiodato sodico, un compuesto que oxida especificamente los grupos glicosidicos de
las proteinas, convirtiendolos en residues de aldehido. Los grupos aldehidos generados de
esta manera son altamente reactivos a la hidracina que se encuentra unida a la biotina. El
tratamiento posterior con estreptavidina acoplada a la peroxidasa de rabano (HRP) permitio
revelar la presencia de glicoproteinas por quimioluminiscencia, usando el sistema comercial
"ECL plus". Para los ensayos de deglicosilacion se utilize un sistema comercial, procedien-do
segun las instrucciones del fabricante (E-Degly, Sigma).
12
3. RESILTADOS
Mediante tecnicas de western blot sobre fracciones purificadas de membrana plasma-tica
de las lineas celulares SN56 y HT22 hemos revelado la presencia de proteinas inmuno-reactivas
a una serie de anticuerpos dirigidos contra las diferentes regiones del REa clasi-co,
CUV as caracteristicas se describen en la Tabla 1 . Los resultados muestran que todos los
anticuerpos, excepto el HI 84 dirigido contra la region amino-terminal, reconocen una pro-teina
de 67kDa en las fracciones de membrana (MP), del mismo tamafio que el receptor alfa
clasico nuclear presente en los extractos totales (Total) de ambas lineas celulares (Fig 1 A).
Sin embargo, el HI 84 es capaz de reconocer la isoforma de 67kDa en fracciones de mem-brana
plasmatica mediante ensayos de inmunoprecipitacion con este mismo anticuerpo o
con el AblO (Fig 2). Ademas, hemos observado tanto en extractos totales como en fraccio-nes
purificadas de la membrana plasmatica de ambas lineas celulares, la presencia de una
proteina de ma\ or peso molecular (80kDa), que es reconocida por todos los anticuerpos uti-lizados
excepto por el ER21 y el HI 51 (Fig lA). En conjunto, estos datos sugieren la exis-tencia
de, al menos, dos proteinas parecidas al REa nuclear en la membrana plasmatica de
las dos lineas neuronales SN56 y HT22.
La existencia de una forma del REa de mayor tamafio (80kDa) en las dos lineas celu-lares
nos llevo a considerar la posibilidad de que esta pudiera ser una forma glicosilada de
la proteina de 67kDa, que le pudiera conferir un patron electroforetico diferente, tal > como
Expresion ciel REa en fracciones de membrana de las
celulas SN56 y HT22
SN56 HT22
80 KDa _
67 KDa —
80 KDa _
67 KDa —
^
80 KDa _
67 KDa —
80 KDa _
67 KDa —
80 KDa _
67 KDa —
~w ^ ^^^
ER21
H184
H151
AblO
MC20
r*
"^
^ •
^ •»
-E 2 z
^z
Total MP Total MP
Figura 1. A) Analisis por Western Blot de la expresion del REa en fracciones purificadas de membrana plasmati-ca
(MP) de las lineas celulares SN56 y HT22. Los extractos totales (Total) se tomaron como control. (*) Ausencia
de reconocimiento de la banda de 67 kDa por el HI 84.
13
Ensayos de inmunoprecipitacion de REa
en fracciones de membrana de las celulas SN56
(A) (B) (C)
MP Total MP Total MP Total
80KDa
67KDa
IPH184 MCF-7 IPH184 MCF-7 IPAblO MCF-7
WBAblO WBH184 WB H184
Figura 2. Ensayos de inmunoprecipitacion en fracciones de membrana (MP) de SN56. (A) y (B): En condiciones
no desnaturalizantes (nativas) el anticuerpo HI 84 inmunoprecipito la banda de 67kDa en membrana (IP HI 84), y
fue reconocida por western blot con este mismo anticuerpo (WB H184) y el AblO (WB AblO). (C): Cuando se
inmunoprecipito la forma de 67kDa en membrana con otro anticuerpo (IPAblO), el H184 fue capaz de reconocer-la
tambien por western blot (WB HI 84). Como control de los western blots se usaron extractos totales de la linea
celular MCF-7.
se ha descrito para el receptor de androgenos (McCANN et al., [16]). El analisis de los posi-bles
sitios de glicosilacion del REa de raton se examino utilizando una herramienta bioin-formatica
disponible en las bases de datos intemacionales, introduciendo en la misma la
secuencia de aminoacidos del REa (JULENIUS et al, [9]). Los resultados muestran que en
esta proteina no hay ningun sitio probable de A^-glicosilacion (Fig 3A), pero si diversos
sitios con una probabilidad media de ser susceptibles a O-glicosilacion (Fig 3B). Sin embar-go,
posteriores ensayos de deglicosilacion con enzimas (9-/7V-deglicosilasas no produjeron
variaciones en la movilidad electroforetica de esta proteina (MARIN et al., [14]), indicando
que el incremento en el peso molecular no parece ser debido a la presencia de un gran nume-ro
de grupos glicosidicos. No obstante, los ensayos de deteccion de proteinas glicosiladas
realizados en extractos totales y en fracciones de membrana de SN56 y HT22 revelaron la
presencia de glicoproteinas del mismo peso molecular que la forma de 80kDa (Fig 4A). En
ausencia del agente oxidante que proporciona el sistema comercial utilizado para detectar
proteinas glicosiladas (ver material y metodos), no se aprecio marcaje alguno ni siquiera
para la transferrina, usada como control positivo por ser una proteina glicosilada. Para
demostrar que el marcaje obtenido a 80kDa se debia especificamente a la presencia de pro-teinas
glicosiladas, realizamos un tratamiento previo con enzimas deglicosilasas. Los ensa-yos
de deglicosilacion con O-deglicosilasas eliminaron el marcaje a 80kDa obtenido con el
sistema de deteccion de glicoproteinas, permaneciendo exclusivamente en el extracto que no
fue deglicosilado (Fig 4B). Estos resultados indican que aunque la glicosilacion no parece
explicar este aumento del tamano molecular, la proteina de SOkDa presente en los extractos
totales y de membrana plasmatica de las lineas celulares SN56 y HT22 sea probablemente
una forma (9-glicosilada del REa.
14
1
(A)
^rediccion de sitios de glicosilacion
del REa de raton
N-glicosilacion
1
H.tnOlye !.•• pr.dlotrd n-st woo<u 1 •t 1 on lit*. Ir. .»-» 1 »7M-£»m -BOUSC
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1
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1 ©
(B) O-glicosilacion
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® A/B 1 C 1 D 1 E 1 F ©
Figura 3. Prediccion de sitios de iV-/0-glicosilaci6n del REa de raton. Debajo de cada panel se muestra la estruc-tura
esquematica del RE . Las lineas azules representan residuos aminoacidicos que son susceptibles de glicosila-cion.
A) El REa de raton no muestra probabilidad alguna de sufrir .V-glicosilacion en ningun aminoacido de su
estructura proteica. B) En este caso se observan diversos sitios potenciales de sufrir O-glicosilacion a lo largo de
la estructura del receptor. (*) Notese la existencia de un grupo de residuos aminoacidicos en la zona cercana a la
region carboxi-terminal del receptor, con una probabilidad superior a la media (linea de puntos) de sufrir O-glico-silacion.
4. DISCUSION
Un aspecto clave de las flinciones de los estrogenos en el cerebro parece ser su
potencial relevancia en la preservacion y supervivencia neuronal, acciones en las que los
mecanismos no genomicos o altemativos estan cobrando un protagonismo creciente. A pesar
de que se describen cada vez mas ejemplos de fenomenos de neuroproteccion mediados por
estos mecanismos no genomicos o altemativos, se conoce muy poco sobre la identidad
molecular de los receptores de estrogenos no convencionales que estan implicados en los
mismos (MARIN et al, [13]).
15
Deteccion de glicoprotefnas en fracciones de membrana
de SN56 y HT22
(A)
Glicoprotefnas WB MC20 Control negativo
80KDa
67KDa
(B)
80KDa
^HP ^^p
SN56 KT22 TrFe SN56 HT22 SN56 HT22 TrFe
Glicoprotefnas
(-)
Figura 4. Deteccion de glicoproteinas en fracciones de membrana de SN56 y HT22. (A): El sistema de deteccion
de glicoproteinas revelo la presencia de grupos glicosidicos de 80kDa, del mismo peso molecular que la proteina
reconocida por western blot con el anticuerpo MC20 (WB MC20). Como control positivo se utilize la trasferrina
(TrFe), que es una proteina glicosilada. El mismo procedimiento en ausencia de los agentes oxidantes que propor-ciona
el sistema no mostro presencia alguna de glicoproteinas, ni siquiera para la trasferrina. (B): Como control de
la eficiencia del sistema de deteccion de glicoproteinas realizamos previamente un tratamiento con enzimas degli-cosilantes.
El tratamiento de las fracciones de membrana con enzimas 0-deglicosilasas (O) elimino el marcaje de
glicoproteinas. El marcaje a 80kDa permanecio solo en los extractos que no fueron deglicosilados (-).
En nuestro laboratorio, se ha demostrado por primera vez la existencia de un REa de
membrana en las celulas SN56 que participa a traves de un mecanismo de accion alternati-ve
en la neuroproteccion frente a la toxicidad del peptide p-amiloide (toxicidad tipo
Alzheimer) (MARIN et al, [12]). Basandonos en tecnicas inmunoquimicas (western-blot e
inmunoprecipitacion), hemos abordado un estudio comparative sobre la estructura molecu-lar
de los recepteres de estrogenes presentes en la membrana plasmatica de las lineas neu-ronales
SN56 y HT22, en relacion a su hemolegia con el REa nuclear clasico (MARIN et
al, [14]). Para ello, utilizames una bateria de anticuerpos dirigides centra diferentes regio-nes
de este receptor clasico que fueron expuestos a extractos proteices de fracciones purifi-cadas
de membrana plasmatica de las des lineas celulares mediante ensayos de western-blot.
Los resultados demestraron que las bandas electroforeticas eran reconocidas por la mayeria
de estos anticuerpos, indicando que las formas extranucleares (e de membrana) comparten
la mayeria de los dominies estructurales del RE nuclear clasico. Estos resultados estan en
concerdancia con dates previes en los que se demostro que una parte impertante de los
recepteres de estrogenes identificados a nivel de la membrana plasmatica (REm) de neuro-nas
presentaban homolegias con los REs clasices (NORFLEET et al, [19]; PAPPAS et al,
[20]; WATSON et al, 2002 [25]). Aunque con algunas excepciones, la hipotesis mas gene-ralizada
supone que el REm y el RE nuclear podrian eriginarse a partir de un transcrite
cemun (LEVIN [10]; WATSON & GAMETCHU [24]).
16
Asimismo, la existencia de proteinas de mayor peso molecular (>67kDa) ha sido des-crita
tambien en varios tejidos de origen neuronal, como en corteza cerebral de raton
(1 12kDa) (ASAITHAMBI et al., [1 ]), en septum e hipocampo de raton (97kDa) (MARIN et
al., [14]), e incluso en humanos (80kDa). Una explicacion razonable al incremento en el
peso molecular de estos receptores seria que fueran el resultado de algiin tipo de modifica-cion
post-traduccional del tipo glicosilacion, tal y como sucede en el caso del receptor de
androgenos (McCANN et al., [16]). Sin embargo, estudios previos realizados en nuestro
laboratorio mostraron que estas proteinas no sufren cambios en la mo\ ilidad electroforetica
tras el tratamiento con enzimas deglicosilasas \ que por lo tanto. la diferencia en el peso
molecular no puede deberse a la adicion de un numero considerable de grupos glicosidicos.
Otra posibilidad es que estas proteinas scan el resultados de un procesamiento o "splicing"
altemativo del ARN, tal y como se ha descrito en la linea celular de cancer de mama huma-no
MCF-7, en la que se expresa una forma de 80kDa como resultado de la duplicacion de
los exones 6 y 7 (PINK et al, [22]). Esta hipotesis esta siendo actualmente explorada en las
lineas celulares SN56 y HT22.
Las modificaciones post-traduccionales regulan importantes aspectos de la biologia
del RE, ya que esta molecula carece de dominios hidrofobicos que le permitan su insercion
a la membrana plasmatica (MARINO et al, [15]). Algunas, como la palmitoilacion (adicion
de acido palmitico) podria explicar la presencia de RE en la membrana plasmatica. Otras
modificaciones parecen estar mas relacionadas con la regulacion molecular del RE. A pesar
de que en nuestros modelos experimentales la glicosilacion no parece ser el mecanismo res-ponsable
del incremento en el peso molecular del receptor, los ensayos de deteccion de gli-coproteinas
revelaron la presencia de proteinas glicosiladas con el mismo tamafio que el
receptor de 80kDa en la membrana plasmatica de las celulas SN56 y HT22. En este orden
de ideas, se han descubierto recientemente en raton varias poblaciones celulares del REa
modificadas por O-glicosilacion, lo que parece estar relacionado con la regulacion de la tasa
de degradacion del receptor, es decir, con la preser\aci6n estructural y funcional de la pro-teina
(CHEN & HART [5]).
5. CONCLUSIONES
1) Los resultados obtenidos en este trabajo de investigacion demuestran la existencia
de varias formas del RE (67 y 80 kDa) en la membrana plasmatica de las lineas neuronales
SN56 y HT22, las cuales son estructuralmente homologas al REa nuclear.
2) Ademas, se ha demostrado en estas mismas lineas celulares la existencia de pro-teinas
glicosiladas con el mismo peso molecular que la forma de 80kDa del RE de tipo
alfa presente en la membrana plasmatica, lo que podria proporcionar un patron de regula-cion
similar al del RE nuclear en relacion a la preservacion estructural y funcional de la
proteina.
3) Aunque es necesario profundizar en el estudio de las propiedades moleculares de
estas formas alternativas del REa, el alto grado de homologia estructural, y probablemente
de regulacion de las formas nucleares \ de membrana, sugieren que ambas proteinas pudie-ran
tener un origen comun.
17
6. AGRADECIMIENTOS
Financiado por los proyectos PI2003/154 (DGUI, Gobierno de Canarias), SAF2001-
3614-C03-01 (MEC), SAF2004-08316-C02-01 (MFC), PI042460 (ISCIII, FISS), y C03/06
(ISCIII, FISSS). Raquel Marin Cruzado es investigadora dentro del "Programa Ramon y
Cajal" y Cristina M. Ramirez Hidalgo es becaria del subprograma de Formacion de Personal
Investigador del Ministerio de Educacion y Ciencia.
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