La fiujación simbiótica del dintrogeno

              Rev .Acad .Canar .Cienc , , V (Num. 4), 59-115 (1993)
LA FIJACION SIMBIOTICA DEL DLMTROGENO
UNA REVISION GENERAL ( *
)
A.M. Gutierrez-Navurrod) , M.A. Leim-Barrios (I) y J. Cor/.o (2)
DepartamenH)s de MicR)hiologia y Biologi'a Celular(l) y de Buiqui'mica y Biolugi'a Molecular (2).
Universidad de La Laguna. La Laguna. 38206 Tenerife
El nitr^geno es el elemento mds abundante de la hiosfera y consiituye una parte importante (entre
el 8 y el 10 por ciento) de la materia viva. En los suelos se encuentra en torma comhinada y con trecuencia
es el factor limitante para el crecimiento de los vegetales y, por consiguiente, para la productividad de los
ecosistemas. Por el contrario. en el estado de dinitrc'igeno es extremadamente abundante en la atmostera
terrestre (constituye el 76 por ciento en peso del aire) por lo que podrfa ser considerado a priori como una
r'uente practicamente inagotable de este elemento. Ahora bien. dehido a la estructura de su molt^cula, se
trata de un gas extraordinariamente inerte y. por ello, no es utilizable por los seres vivos con la linica
excepciCin de un conjunto de procariotas capaces de tljarlo. es decir. de transformarlo hasta una forma
metabolizahle por lUros organismos.
I. .Microorjianismos tljadore-s de nitroj^eno
La actividad tljadora de nitrogeno consiste en la reducci^n del dinitn'igeno de la atmi'isfera hasta
amom'aco:
N, + 8 H- * 2 NH, + H,
El amom'aco producido es luego incorporado a esqueletos carbonados para la sfntesis de
aminodcidos y otros compuestos nitrogenados. y ello hace que los organismos capaces de efeciuar esia
actividad puedan vivir en ausencia de nitri3geno combinado y sintetizar sus materiales nitrogenados a
expensas. exclusivamente. del nitrt'igeno que hay en la atmostera. Es una actividad que esta catalizada por
un sistema enzimdtico. el complejo nitro^enasa. que solamente se encuentra en un grupo de seres vivos.
(*) Dada la categoria y profundidad con que ha sido tratado el tema
de esta revision, el Comite Editorial ha considerado de gran interes
incluir este trabajo en esta Seccion.
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todos ellos procarii5ticos, que recihen el nombre de diazotrofos y que cada vez se va viendo mis ampliado.
En la actualidad se conocen 80 gt^neros de eubacterias (Tabla 1) y 6 de arqueobacterias (Tabla 2) que
incluyen una o mds especies diazotrotas.
Tabla 1 Clasificacion de las eubacterias diazotrotas.
Grupos tlsiologicos Generos y numero (entre parentesis) de especies diazotrotas
Heterotrofas
Aerobias
Azotobacteriaceae
Acetobacteriaceae
Pseudomonadaceae
Methylomonadaceae
Rhizobiaceae
Spirillaceae
Beggiatoaceae
Actinomycetes
Afiliacion dudosa
Anaerobias facultativas
Enterobacteriaceae
Vibrionaceae
Bacillaceae
Atlliacion dudosa
Anaerobias
Bacillaceae
Afiliacion dudosa
Fototrofas
Anoxigenicas
Rhodospirillaceae
Chromatiaceae
Ectothiorhodospiraceae
Chlorobiaceae
Chlorotlexaceae
Afiliacion dudosa
Oxigenicas
Chroococcaceae
Nostocaceae
Rivulariaceae
Scytonemataceae
Oscillatonaceae
Stiszonemataceae
Azorobacier(6), AzomoiuLs(3), Bc'ijennckia(4), Derxia(l), Xaniho-bacter(
3)
Acetobacter(2)
Pseudomonas{6)
Merhylosinus(2), Merhylocysrisd), Methylocucciis(4), Methylobac-rer(
l), Methylomonas(2). Microcyclus(4), Renobacteril).
Rhizobium(5), Bradyrhizobium(l), Azorhizobiuind ), Phutorhi-zobium(
l), Agrobacteriuin(l)
Azospirilliini(5), Hcibaspirillunu I ) , Aqiiaspihlluini4), Ccviipylobac-rer(
l)
Beggiaioad
)
Frankia(l)
Alcaligeiu's(3), Tliiobacilliis(]
)
Citrohacter(2). Klebsiellu(4), Enterobactcr(3), Envinin(l)
Vibrio (4)
Bacillus (3)
Mycoplana(2)
Clostridium (12), Desulfotomaculum 1 3)
Dc'sulfovibrio(7) , Desulfobaacr(4)
Rhodobactcri5), Rhodopseudonioiuisl?). Rlu)dospirilluin(5),
Rhodopilad) . Rhodomicrobiuiu (1). Rhodocyclus(2)
Chromariuin(7), Lawprobaaer(l), Tliiocystisd), Tltiocapsa(2),
Amoebobacteril)
Eaorhiorhodospira(2)
Chlorobium(4), ChlorohcrpcrondJ, Pelodyctiond ), Prosfheco-chloris(
l)
Chlorojlexusd)
Hcliobacwriumd)
Gloeothece(l)
Anabaenad2)Anabaenopsisd)Aphanizomenon(l),Aulorisa(l).
Chlorog loea (1 ) , CyUiidrospermum (4) , Gloeoirichia (1 )
,
Nodularia(l),Nosroc(8) , Trichodesniium ( 1
)
Calorhri.x(5)
Scytonema (2) , Tolyporh ri.x 1 1
)
Oscillatoriad), Plecronemad ), SchizolhrLxd
)
Fisdwrella(2) , Hapolosiphon (I), Masiigocladusd), Sri^oncnia (1).
Westelliopsis(l)
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Tahia 2 Clasificacion de las arqueobacterias diazotrofas
Grupos tlsiologicos Gcneros y niimero (entre parentesis) de especies diazotrotas
Metandgenas
Methanococcales
Melhanobacteriales
Methanomicrobiales
Methanothermaceae
Haldfilas
Halobactenaceac
Methanococcus(5)
MeihaiH)hactc'rium(3)
MethaiioU)bus(l ). MelhanuscircimU I
)
Meih(uiathermus(2)
Halobaclcnunill j
Algunos diazotrot'os solamente pueden tljar el nitr6geno atmost«^rico en simbiosis con plantas perte-necientes
a varias tamilias vegetates. Son los denominados tljadores simbic^ticos del nitn^geno. que se
agrupan fundamentalmente en cuatro gt^neros: Rhizobium, Bradyrhizobium. Azorhizohium y Frankia. Las
resiantes bacterias diazotrotas se denominan tljadt)res libres del nitrtlgeno y son de tlsiologi'a diversa. Entre
ellas. las hay fototrotas oxig^^nicas (algunos g<^neros de cianobacterias) y anoxig^^nioas como algunas
especies de Rhodopseudomonas, Rhodobactcr o Chromatium. Entre las organotrot'as las hay anaerobias
tacultativas (pertenecen a este grupo. por ejemplo, algunas especies de los g^^neros Klebsiella, Enterobacter.
Citrobacter, Envinia, Vibrio o Bacillus), anaerobias estrictas. como las pertenecientes al gifnero Clos-tridium,
y aerobias estrictas. como las de los gt^neros Azospirillum, Azoiobaaer, Azomonas, Beijerinckia
y Derxia. asf como algunas estirpes de Pseudomonas y de metilobacterias. Tambi^^n hay arqueobacterias
diazotrotas como las metanc')genas y Halobacterium halobium (Tabla 2). lo que sugiere que estamos ante
una actividad metabtllica de origen evolutivo muy antiguo, quizes mds que la propia fotosfntesis. y eilo
podrfa explicar tambit^n la extrema sensibilidad al oxfgeno que presenta la nitrogenasa.
La principal limitacion que tiene la tljaci^n libre del nitr6geno se deriva del hecho comentado de
que el complejo nitrogenasa no es activo en condiciones aerobias y solamente tuncitma cuando estd
debidamente protegido del oxfgeno gaseoso; asf se explica que las bacterias tacultativas tljen el nitrt'igeno
atmostt^rico s61o cuandt) son cultivadas en anaerobiosis. En el caso de los diazotrot'os aerobios la proteccicin
de la nitrogenasa se logra. entre otros mecanismos. mediante una intensa actividad respiratoria que impide
el acceso del oxfgeno a los lugares en los que radica el complejo enzim^ltico. Pero ello exige el consumo
de ingentes cantidades de materia org:inica que ha de ser utilizada como sustrato respirable para llevar a
cabo dicha proteccic^n de la nitrogenasa. Ademls. el proceso tljador del nitrc*>geno es muy enderg6nico y,
en consecuencia, para que tenga lugar, son necesarias grandes cantidades de ATP que se obtienen tambit^n
mediante la respiracic'in de materia org^nica: se calcula que la reducci^n de un mol de dinitrt^geno consume,
como mfnimo. 16 moles de ATP. De esta pequefia discusit'in cabe deducir que es poco probable la
existencia en los suelos de semejantes cantidades de materia org^lnica, lo que limita considerahlemente e!
papel de la tljaci(5n libre del nitrc^geno. al menos en los suelos de climas templados (mayor importancia
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puede tener en las zonas tropicales. en las que los aportes de residues vegetales a los suelos son mayores).
Por otra parte, el complejo nitrogenasa se inhibe por el amonio, producto de su actividad catalftica sobre
la mol^cula de dinitr^geno y. por esta raz6n, es poco probable que las bacterias fijadoras libres puedan
acumular en su citoplasma cantidades de amonio suficientes como para ser excretadas al suelo, lo que indica
que el posible nitr(5geno liberado como consecuencia de la tljaci^n libre lo seria casi exclusivamente en
forma orgdnica. no asimilable directamente por los vegetales, que. como es sabido. asimilan el nitrdgeno
en las formas amdnica y nitrica. Por ello, ha de sufrir varias transformaciones. tambit^n efectuadas por
bacterias: en primer lugar, la mineralizaci6n libera amonio que es oxidado. primero a nitritos y despuiis
a nitratos. En todos estos procesos se produce la inmovilizaci6n del nitrdgeno. ya que la microtlora que
lo transforma tambii^n lo utiliza como nutriente para su propio crecimiento.
2. Fijacion simbiotica del nitrogeno: introduccion
Todos los problemas senalados se soslayan en el caso de la tljaci^n simbiotica del dinitrclgeno: en
primer lugar. el aporte de materia org^nica lo efectiia la propia planta hospedadora, mediante su actividad
t'otosintetica; el tbtosintato es transportado hasta el sitio de fijaciOn y alli oxidado por la bacteria para
obtener el ATP necesario para el tiincionamiento del complejo nitrogenasa. Adem^s, el amonfaco producido
en el proceso tljador es r^pidamente incorporado en los esqueletos carbonados, tambit^n suministrados por
la actividad tbtosint(Jtica del hospedador. lo que impide la inhibicic3n de la nitrogenasa a que antes
aludiamos. Por ultimo, el producto tlnal de la tljaci6n del nitr6geno (generalmente, amidas, ureidos o
amino^cidos) es utilizado directamente por la planta. Esto justifica el hecho de que, desde el punto de vista
cuantitativo, la tljaciOn simbi6tica dei nitrOgeno tenga mayor importancia que la tljaciOn libre. Asf. segiin
datos de Mishustin y Shil'nikova [240], la fijaci6n libre efectuada por las cianobacterias supone una
cantidad de 22 kilogramos de nitrOgeno por hect^rea y ano; a Azotobacter son atribuibles 0,26 kilogramos
por hect^rea y ano y a Clostridium. 0,22. Sin embargo, una hectdrea de terreno bien abonado en el que se
cultiva alfalfa en simbiosis con bacterias del genero Rhizobium tlja cada ano una cantidad de nitr6geno
equivalente a mds de 264 kilogramos; en el caso del tr^bol, se tljan en las mismas condiciones unos 220
kilogramos y en el del altramuz, unos 132 kilogramos. No es extrano, pues, que la mayor parte de los
trabajos publicados en relaciOn con la tljaci6n del nitr6geno atmosft^rico se refieran a los procesos de
tljaciOn simbi6tica.
Hace unos 2.000 aiios en la (^poca de la Roma antigua, era conocido y se utilizaba el hecho de que
las leguminosas contribuyen a mantener la fertilidad de los suelos. Por ello, se convirti6 en una pr^ctica
agricola habitual la rotaci6n de cultivos de leguminosas y trigo. Como tantas otras cosas, esta pr^ctica cay6
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en el Dlvidi) en la oscura Edad Media y no fue redescubieria hasta mediados del siglo XVIII en el condado
de Nt)rtolk (Inglaterra) porque CDmo senalaha Sir Humprey Davey en 1.813 "Uys f^uisanu's y las judfas
pareecu cspecialmenie adaptados para prcparar lus suelos para el culiivo del tri}>o"
.
Este sistema roiacional de culiivos se extendi^ pronto al Coniinente y permiiid la esiabilizaci6n
agricola y la Iiberaci6n de mano de obra del campo. que, junto con las teori'as ea)ni5micas de Malthus.
hicieron posible la revolucii'in industrial acaecida en el siglo XIX en la Europa Occidental.
Sin embargo, esta capacidad de las leguminosas no se relacionc') con la presencia de nc'idulos en las
rafces de estas plantas, que habi'a sido ya descrita en 1.675 por Malpighi. hasta que en 1.838 Boussingault
demosirti de una manera clara que las leguminosas tljaban el nitr6geno de la atmi'ist'era y, cincuenta anos
mis tarde, Hellriegel y Wilt'art demostraron que scllo pueden hacerlo las que poseen n^dulos radicales.
El aislamiento del primer diazotroto simbic^tico tue realizado en 1.888 por Beijerinck. Hasta
entonces se crei'a que la tljacic^n del nitr6geno en los nddulos de las leguminosas se efectuaba en unos
orginulos. denominados "bacteroides" que, supuestamente. se formaban de novo en las c<^lulas del nc'idulo.
Beijerinck demostrc^ que, en realidad, dichos bacteroides son consecuencia de una serie de cambios que
experimenta una bacteria del suelo que intecta la rai'z, a la que denomin(3 Bacillus radicicola y actualmente
es conocida como Rhizohium leguminosarum. Desde entonces se ban ido aislando nuevos diazotrofos
simbie'iticos, la mayorfa de los cuales lo son con leguminosas, lo que contlere a esta simbiosis su
importancia cuantiiativa. En et'ecto, debe tenerse en cuenta que el de las leguminosas (Familia Fabaceae)
es uno de los grupos vegeiales mis numerosos, formado por unos 700 g<^neros y 14.000 especies. De ellas,
hay unas cien de importancia agrLjla que se cultivan en una supertlcie total de 250 millones de hectireas
y suponiendo una fijaci^n media de 140 kg de nitr(3geno por hectirea y ano. se puede calcular que la
simbiosis permite una entrada a los suelos de 35 millones de toneladas de nitnlgeno al ano en todo el
Planeta.
Como queda dicho, las bacterias que efectiian una tljacit)n simbit)tica del nitrc'igeno se agrupan en
s(51o cuatro gtJneros: Rhizobiunu Bradyrhizobium, Azorhizobium y Frankia. Este liltimo es simbi(3tico con
plantas de diversas familias, pero los tres primeros s6\o pueden establecer la simbiosis con leguminosas (la
linica planta perteneciente a otra tamilia que puede establecer simbiosis con un miembro de las
Rhizobiaceae es Parasponia. planta lenosa de la tamilia Ulmaceae, que es infectada por Bradyrhizobium).
Dado que la distincit)nentre Rhizobium y Bradyrhizobium data de hace unos doce anos [179] y que el
aislamiento de Azorhizobium es aun mis reciente [124], los primeros trabajos que hacen relaciein a ellos
se retleren solamente al gt^nero Rhizobium y en lo que sigue, cuando se utilice el t^Jrmino "rizobio" estari
referido indistiniamente a uno u otro g^nero.
- 63
3. El proceso de inteccion de las lejiuminosas por los rizobios
El estabiecimiento de la simhiosis es un proceso complicado que implica la interacci6n entre ambos
simbiontes. De forma esquemdtica puede ser representado como en la Figura 1. La relacidn simbi6tica
comienza cuando los rizobios son atraidos quimiot^cticamente por los exudados radicales de la planta
hospedadora [82,123,137] y, como consecuencia de ello, proliferan abundantemente en su rizostera.
Cuando est^n pr6ximos a la raiz, los rizobios se unen a las C(^lulas superficiales (pelo radical y c^^lulas
epidtSrmicas) por mecanismos no bien conocidos, aunque posiblemente impliquen la interacci(3n de
macromolt^culas complementarias. Asf las lectinas presentes en la rafz de la leguminosa podrian unirse a
componentes especfficos de la superficie del rizobio. Las fibrillas de celulosa producidas por Rhizobium
pueden ayudar a esta unidn al t'avorecer que la bacteria quede atrapada en la superficie de la raiz [193].
Por otra parte, esta unic'in podri'a favorecerse por las ricadesinas (proteinas que ligan Ca-* especiTicas de
las Rhizt)biaceas). Si bien hay consenso sobre el papel de las lectinas en esta uni^n, mayor controversia
existesobre el componente polisacarfdico superficial del rizobio que las reconoce [26,68]. Asi, paraalgunos
autores son las propias tlbrillas de celulosa [193]; para otros, los polisac^ridos extracelulares o capsulares
[66,67] y para otros, en fin, los lipopolisac^^ridos de la pared [188,220,384]. Nosotros disponemos de una
coleccic^n de rizobios aislados de leguminosas endt^micas del Archipi^^lago Canario. que, pese a lener la
misma gama de hospedadores, muestran polisac^ridos extracelulares de diferente composici6n qufmica
[208,209]. De cualquier forma, sean o no responsables del reconocimiento inicial, los componentes
superficiales del rizobio parecen desempefiar una importante funci6n en la simbiosis y son numerosos los
trabajos que aportan datos que avalan esta afirmaci6n y las descripciones de mutantes no infectivos. cuyos
polisaciiridos no difieren de los de la estirpe parental infectiva [17,249.315]. Tambit^n se ha observado que
las mutaciones que afectan a cualquiera de los componentes polisacarfdicos superficiales de los rizobios
pueden alterar su fenotipo simbicMico. Asf, los mutantes eps (incapaces de sintetizar polisacdridos normales)
difieren en sus capacidades simbic'iticas con diferentes plantas: una misma mutacicin induce un fenotipo Nod'
o Inf en plantas de Pisuni. Mcdica^o y Leucaena, pero no afecta al fenotipo simbidtico sobre
Figura 1. Estadios en la infeccicSn de la raiz de una leguminosa por diazotrofos simbiontes. A. La bacteria es atraida
mediante quimiotaxis a la nzosfera del vegetal y prolifera en ella. B. Se produce una adsorcion especiTica de la
bacteria al pelo radical de la planta. C. El pelo sufre una incurvacion caracten'stica quedando algunas bactenas
atrapadas en la zona incurvada. D. Se produce una invaginacion de la pared y la membrana del pelo radical, para
formar el tubo de infeccion que avanza a traves de las celulas corticales del vegetal (E), ranuficandose.
Simultaneamente se mduce un toco de proliferacion celular formandose el primordio del nodulo. F. Representacion
esquematica de un corte de un nodulo niaduro. 1 . Celula no mtectada, atrave.sada por el tubo de infeccion que contiene
bactenas indiferenciadas; 2. Proceso de infeccion de la celula vegetal por liberacion de vesi'culas por invaginacion de
la membrana citoplasmatica y fusion con vesi'culas procedentes del aparato de Golgi, del reti'culo endoplasmico o de
ambos; los rizobios se diferencian al estado de bacteroide; 3. Celula infectada que contiene los bacteroides alojados
en simbiosomas, limitados por la membrana peribacteroidea.
64
B
7 . qu imioatrayen te
iininn nnlar AsnArifira
pda radical
^% /^
—• 1 receptor superficial
:^
— |fc ^ ^ ^(Brady)Rhizobium
rizosfera
unior1 al azar
>
^ receptor del pelo
pared celular
D
°^ zona de mitosis
<D O
Q> YX
1 ^>*—"^
1
tubo de - -•^^"^
in feed on ^ ^ ^ 11
4
membrana
pared -^
de infeccion
nodulo en desarrollo
65
Phaseolus, Glycine y Uhus | I64a|. Por otro lado, los mutantes en los lipopolisacdridos tienen un fenotipo
Fix en Phaseolus y Glycine 1282a] y sin embargo, mutaciones en los lipopolisac^ridos de R. meliloti
pueden o no afectar al fenotipo simbi^tico con alfalfa [106,205].
La respuesta inicial del pelo radical a la presencia de Rhizobium consiste en un incurvamiento para
adoptar la forma de un cayado de pastor. El extreme incurvado engloba una o m^s bacterias que invadir^n
el pelo radical. La infecci6n comienza con la formaci6n de un tubo de infecclon que se Inicia por la
disolucidn enzim^tica de la pared del pelo radical [13,48] y la invaginaci6n de la membrana citoplasm^tica
de dicho pelo, a cuyo alrededor se depositan nuevos materiales idt^nticos a los de la pared celular [192,283]
que afslan al rizobio infectante. Se calcula que el tubo, que avanza por la ct^lula precedido por el nucleo
celular [218], alcanza la base del pelo radical al cabo de unas 48 horas [267]. Luego el tubo de infecci(3n
se ramitlca y avanza por las ctJlulas del tejido cortical de la raiz hasta que alcanza un foco celular en
"estado hipersensible" [156]. Recientes estudios permiten sugerir que estas ct^lulas hipersensibles est^n
localizadas en el c6rtex medio de la rai'z y contienen concentraciones anormalmente altas de glicoprotefnas
ricas en prolina y de las enzimas fenilalanina amonfaco liasa y chalcona sintetasa, dos enzimas claves de
la vi'a de biosfntesis de los fenilpropanoides, en la que se producen las fitoalexinas [156]. Por otra parte,
tambit^n se ha observado que las ct^lulas en las que termina el crecimiento del tubo de infeccidn y las
adyacentes contienen compuestos fen61icos en sus paredes celulares [282], lo que sugiere que los sintomas
del estado hipersensible son la lignitlcaci6n de la pared y la acumulaci6n de fitoalexinas.
Las bacterias que han sido conducidas por el tubo de infecci6n hasta las c^lulas corticales del
vegetal proliferan en ^1 y son liberadas al citoplasma de la ct^lula por un proceso endoci'tico (Figura 1),
como consecuencia del cual quedan rodeadas por una membrana de origen vegetal que establece un
compartimento, denominauo simbiosoma. en cuyo interior la ct^lula se divide, pierde su forma bacilar y
se hace mazuda y pleomc'irfica; entonces aparece el sistema nitrogenasa y otros complejos enzim^ticos
necesarios para la fljaciiln del nitr6geno. En este estado. la bacteria recibe el nombre de bacteroide,
conservando la primitiva denominacidn de los supuestos org^nulos fljadores de nitr6geno que se habi'an
descrito en las c<^lulas de los n6dulos radicales de las leguminosas. En una leguminosa que flja activamente
nitr6geno pueden encontrarse hasta 10.000 bacteroides por n6dulo, que est^ compuesto de partes
aproximadamente iguales de tejido vegetal y de bacterias [267]. Por otra parte, aunque el bacteroide
requiere oxfgeno para la producci6n de los altos niveles de ATP necesarios para el funcionamiento de la
nitrogenasa. ;^sta, como queda dicho, es extremadamente sensible al oxfgeno. cuyo nivel en el interior del
nc)dulo se controla por una hemoprotema, similar a la hemoglobina de la sangre de los vertebrados que
recibe. por ello, el nombre de leghemoglobina.
La formaci(3n del n6dulo radical exige que las celulas corticales de la rai'z se dividan, pero, a
66
diterencia de las implicadas en la tbrmaci(^n de las rafces laterales. estas divisiones son aniiclinales; por oira
parte, no se inician en las c«51ulas por las que avanza el tubo de inteccii3n, sino que lienen comienzo en
c^lulas que estin separadas por varias de ellas del exiremo del tubo en progresi6n. La localizaci6n de las
divisiones celulares iniciales presagia el tipo de n(3dulo que se va a formar y. a su vez, esto depende de la
planta y no del rizobio (61.250). Cuando las divisiones celulares se inician en una zona interna del ccinex
del vegetal, como ocurre en la mayor parte de las leguminosas de climas lemplados. como el guisante, la
veza. el ir^hol o la alt'alfa. se torman nt^dulos que recihen el nombre de indeterminados porque crecen
indefinidamente y tienen forma alargada. mazuda (212,251]. Por el conirario, cuando las divisiones
celulares se inician en la zona e.xterna del ci3nex se originan ni5dulos determinados. de mortologia esf«5rica,
que son caracterfsticos de leguminosas como la soja. la judi'a comiin o diversas especies de Lotus (25 1 ,303).
La diferencia citolCigica fundamental entre ambos lipos de nddulos radica en la existencia en los
indeterminados de un meristemo persistente que se local iza en el extremo apical y hace que el n(3dulo crezca
fundamentalmente por division y posterior diferenciaci^'>n de las c«51ulas. La forma alargada se debe a que
se van anadiendo permanentemente nuevas c^Jlulas en el extremo del ni3dulo en el que se localiza el
meristemo. Por otra parte, dado que en el nddulo indeterminado existe un gradiente en la edad de las
c<^lulas desde el extremo apical hasta la base proximal por la que se une a la rai'z. en ^\ se encueniran
represemados todos los estadios del desarrollo nodular (Figura 2). En el caso de los ntMulos determinados
no existe meristemo y, por consiguiente. el crecimiento del nodulo se debe mas al aumento en tamano de
las cs^lulas que a su division; por ello, se trata de nc^dulos de morfologia esf^rica.
Ambos tipt^s de ni.'>dulos se diferencian tambiiJn en los compuestos nitrogenados que se sintetizan
en ellos y son transportados a otras partes de la planta: en los indeterminados se forman amidas: en los
determinados. ureidos [1561.
El modelo general que acabamos de describir tiene algunas excepciones. Asf en algunos casos. las
bacterias no son liberadas del tubo de infeccii3n al interior del citoplasma. Tal es el caso. por ejemplo. de
mutantes auxotrofos para la leucina de Rhizobium meliloii simbiontes con alfalfa [357], y el de rizobios
silvestres que infectan a Parasponia [280] o a algunas leguminosas arb^^reas [101.103]. En estos casos las
C(Jlul'is del ntidulo se ven atravesadas por tubos ramitlcados que contienen los bacteroides, y a los que en
ocasiones se ha denominado tubos de tljaciCin [102].
El nc'idulo radical, cualquiera que sea su clase es el nicho microaeri.'it'ilo en el que tiene lugar la
tljacii3n de nitr^geno. Ya se ha indicado que los rizobios son bacterias aerobias obligadas y que la tljacidn
del nitrogeno es un proceso endergonico. sensible al oxi'geno: estas dos caracteristicas, aparentemente
irreconciliables se armonizan en el interior del ni3dulo ladical, cuyos tejidos centrales infeciados tienen
tensiones de oxfgeno muy bajas que facilitan la aciividad fijadora del bacteroide. En efecto. cerca de la
67
Indeterminado Determinado
Fiyura 2. Organizacion citologica de los nodulos deterrrunados e indeterrrunados descritos en las leguminosas. HV,
haz vascular; M, meristemo; S, zona de senescencia; ZFN, zona fijadora de nitrogeno; ZST, zona simbiotica
temprana; ZTI, zona temprana de infeccion.
periteria del n6dulo existe una capa continua de C(^lulas vegetales no infectadas que restringe y regula la
difusic'in del oxigeno gaseoso hacia las zonas internas, que se mantienen, por ello, con unas tensiones de
oxi'geno disuelto, aproximadamente cien veces menores que las atmosft^ricas (0,2 por ciento), valor
suficientemente bajo como para que la nitrogenasa pueda efectuar su accidn catalitica. Adem^s, como una
adaptacion adicional para la creacie)n de un ambiente microaer6filo para los rizobios, las cc^lulas infectadas
que se localizan en los tejidos internos, contienen grandes cantidades de leghemoglobina. cuya funci6n es
tacilitar la ditijsi6n del oxi'geno a bajas concentraciones por el citoplasma de la ct^lula vegetal infectada.
aportando al rizobio un tlujo de oxigeno sutlciente para llevar a cabo la respiracii5n y la tbsforilaci6n
oxidativa [38].
4. Bioqui'mica y genetica de la nitr()}»enasa
4.1. Componentes del sistema nitrogenasa
El mecanismo de fijaci6n del nitrogeno parece muy similar en la mayor parte de los organismos
diazotrofos. Un avance importante en el conocimiento del proceso tljador se produjo cuando se demostrt")
que la reducci6n del nitrogeno hasta amonfaco podia ser etectuada in vitro, en presencia de piruvato,
utilizando extractos libres de ctJlulas de Clostridium pasteurianum [51]. Posteriormente se comprob6 que
68
el proceso redujtor dependiente de piruvato podfa ser separado en dos componentes: uno de ellos era un
sistema fosforocldsiico en el que el piruvato es oxidado para producir ATP y poder reducior; el otro. al
que se le dio el nomhre de nitrogenasa. reducia el nitr^geno utilizando para ello el ATP y el poder reducior
generados.
El sistema nitrogenasa ha sido aislado y en muchos casos puritlcado a panir de muchos diazotrotos.
tanto de vida libre como simbit^iicos y en lodos ellos liene una estruciura similar. En el aislamiemo. se
separa en dos componentes (243). El primero de ellos se denomina ferro-protema. nitrogenasa-reductasa,
azoterredoxina, o componente II: contiene cuatro itomos de hierro y cuatro itomos de azufre l^biles. que
constituyen un centro 4Fe-4S ( 125.258], al que se unen de forma sims^trica dos subunidades pollpepiidicas
idtJnticas, de peso molecular variable entre 29.000 y 36.500 y de secuencias de aminodcidos muy
conservadas, como se deduce de la alta homologfa del gen nifH que coditlca para la terro-proiei'na de
Klebsiella pneumoniae y de Rhizobium meliloti. La tunci6n de esta ferro-proteina es la de actuar como
reductor especiTico para el segundo componente de la nitrogenasa (333.3341.
El otro componente. denominado ferromolibdo-protema. dinitrogenasa, azofermo o componente
I. es un tetrdmero de estructura a:l3:. La suhunidad a tiene un peso molecular aproximado de 56.000 [244)
y estd codificada por el gen nifD, mientras que la suhunidad B es algo mayor (peso molecular, 60.000,
[244] y esti coditlcada por el gen nifK. Como en el caso de la terro-proteina. las secuencias de aminodcidos
de estas cadenas polipepti'dicas estdn muy conservadas. El andlisis elemental demuestra que contiene 2
dtomtis de molibdeno y entre 24 y 32 dtomos de hierro [258.392]. Dado que el numero de itomos de azufre
liibiles es el mismo que el de dtomos de hierro, se puede admitir que ambos se encuentran formando centros
Fe-S. De hecho. parecen existir seis de estos centros metdlicos. dos de ellos del tipo 4Fe-4S. que se
denominan fentros P y dos del tipo 6Fe-8.\lo-6S. denominados centros .\1 o cofactores de hierro y
molihdeno. FeMo-co [88.331].
Existen otras nitrogenasas. denominadas alternalivas. por lo que la dependiente de molibdeno, cuya
estructura acabamos de comentar, recibe el nombre de nitrogenasa I. En efecto, desde antiguo venia
siendo conocido que algunos diazoirofos pueden fijar el nitrc'igeno en ausencia de molibdeno. por lo que
se postulaba la existencia en ellos de una dinitrogenasa diferente que no requiriera este metal. El problema
fue resuelto cuando se determine") la existencia de una nitrogenasa 2. cuyo componente I utiliza vanadio
en lugar de molibdeno y es denominada VaFe protei'na [23.90.323]. Posteriormente. se ha aislado un tercer
tipo de nitrogenasa. denominada nitrogenasa 3. que posee una Fe-Fe protei'na [59]. Todas las nitrogenasas
tienen en comiin estar formadas por dos componentes metaloproteicos. el componente 1. o dinitrogenasa,
que contiene el sitio activo de la enzima. y que puede llevar un cofactor FeMo-co. o FeVa-co, o FeFe-co,
y el componente II, o nitrogenasa reductasa, que reduce especiTicamente al componente I. Este segundo
69
componente es siempre una ferro-protefna con un centro met^lico del tipo 4Fe-4S.
4.2 Funcion catalftica de las nitrogenasas
Al parecer, el fiincionamiento de los tres tipos de nitrogenasa tiene los mismos requerimientos: son
necesarios, adem^s de los dos componentes del sistema y de magnesio, un reductor de bajo potencial, ATP
y condiciones microaer6filas [59]. Dado que el primer sistema nitrogenasa descrito fue el dependiente de
molibdeno, es el m^s estudiado y del que se posee un mayor cuerpo de conocimientos. Adem^s de su
sustrato natural, el dinitr6geno, la Mo-nitrogenasa puede reducir a otros sustratos diferentes (azida, cianuro
acetileno y protones, entre otros), que se comportan como inhibidores de la tljaci^n del nitrdgeno [41]. Un
sustrato alternativo de la nitrogenasa que tiene gran intertSs es el acetileno. En efecto, la reducci6n de
acetileno a etileno por la nitrogenasa es muy etlcaz: la Km de la enzima para este sustrato es 0,1 mM,
similar a la que tiene para el N. y el producto, el etileno puede ser f^cilmente detectado por cromatogratTa
de gases. Por ello, la actividad in vivo de la nitrogenasa se ensaya utilizando acetileno como sustrato en
lugar de nitr6geno molecular. Dado que la reducci5n del acetileno requiere s61o dos electrones, en lugar
de los seis necesarios para la reducci^n del dinitr^geno hasta amonfaco, cabe esperar que la relacic5n N^
tlj ado /etileno producido sea de 1 :3. Sin embargo, los valores reales obtenidos ditleren de este valor te6rico,
en funcicin del sistema experimental empleado, del material biok5gico utilizado y en el caso de los m'idulos
radicales, de la presencia en ellos de etileno que, como es sabido, es una hormona vegetal. Esto limita en
gran medida la utilizaci6n del test de reducci(3n del acetileno para estudios cuantitativos, aunque sigue
siendo de gran utilidad, por su sencillez y sensibilidad, para estudios cualitativos. Otra aplicaci6n de este
procedimiento deriva del hecho de que la nitrogenasa dependiente de vanadio tambit^n puede reducir el
acetileno, pero produciendo, adem^s de etileno, etano [72]. Dado que la nitrogenasa dependiente de
molibdeno no forma etano como producto de reducci6n del acetileno, el ensayo de dichos productos permite
detectar el funcionamiento in vivo de nitrogenasas alternativas.
La velocidad del tlujo de los electrones hacia la nitrogenasa es independiente del sustrato e, incluso
en condiciones dptimas para la reducci6n del dinitr6geno, aproximadamente el 25 por ciento de los
electrones suministrados al sistema son utilizados para la reducci6n de protones:
N. + 16Mg-ATP + 8e + 8H^ > 2NH3 + H, + 16Mg-ADP + 16P,
Esta produccic'in de hidrc3geno se cree debida a que la uni6n del N. a la nitrogenasa requiere la
existencia de un sitio reducido en la enzima y que la uni6n del dinitr6geno al mismo desplaza H. [58]. En
efecto, como se puede deducir del mecanismo de funcionamiento de la enzima, expuesto en el esquema de
la tlgura 3, el reductor inmediato del sistema, que en Rhizobium es la ferredoxina (Fd) reducida [52] y en
70
n electrones
(n entre y 7)
FeMoP
n-f-1 electrones
1 e> 1 H^
1 e"+ 1 H"" 1 e"+ 1 H*
[^FeMo^ (^FeMo^ [^FeMcT^ |SJ
^FeMo"^
NH
•^
I Ar^
1 e"+ 1 H*
1 e> 1 H^ 1 e> 1 H^
i N^ ^ H,N-N= y^^r^
r FeMo 1<^—^^^ r FeMo 1
1 e"+ 1 H'
Figura 3. Mecanismo de accion de la nitrogenasa. A. Reduccion de la nitrogenasa (FeMoP) por la nitrogenasa -
reductasa (FeP). B. Ciclo de reduccion del nitrogeno por la nitrogenasa. Cana incorporacion de un electron implica
un ciclo completo como el representado en A.
71
Klebsiella pneumoniae, la tlavodoxina reducida [326], transfiere los electrones a la ferroproteina. que en
presencia de MgATP altera su contormaci6n y se convierte en un componente de bajo potencial. En este
estado la ferro-proteina se combina con la nitrogenasa, hidroliz^ndose el ATP, y le transfiere un electron.
Simult^neamente, el FeMo-co toma un prot6n del medio. Cada vez que tiene lugar la transferencia de un
electron, la ferroprotefna se combina y se disocia del otro componente y tiene lugar la hidr(31isis de dos
molt^culas de MgATP [42]. Como consecuencia de esta transferencia de electrones, se forma un trihidruro
de la enzima [216,352] al que se une la molt^cula de dinitrdgeno desplazando dos ^tomos de hidrdgeno [58].
A partir de este momento, son necesarios cinco electrones adicionales para formar las dos mol^culas de
amonfaco. De estas consideraciones sobre el mecanismo de accidn de la nitrogenasa cabe deducir que la
producci6n de hidrdgeno es un aspecto esencial e inevitable del propio funcionamiento de la enzima.
Aunque la nitrogenasa dependienie de vanadio tiene la misma atlnidad por el N. que la dependiente de
molibdeno, cataliza la reducci6n de protones a H-, en mayor medida y se estima que en este caso al menos
el 50 por ciento de los electrones son empleados para esta funci6n [90].
El aparentemente iniitil consumo de ATP para la producci6n de hidrdgeno es compensado en
muchos diazotrofos aerobios, tanto simbi6ticos como de vida libre, por la accidn de una hidrogenasa
(sistema Hup, de Hydrogen uptake jirotein) muy activa que permite reciclar el hidrdgeno producido. Su
actividad tiene como resultado la generacidn de ATP y una mejora de la eficacia metabdlica del organismo
[100], hasta el punto de que en Bradyrhizobiumjaponicum permite, bajo ciertas condiciones un crecimiento
quimiolitotrofo utilizando H. y CO^ como linicas fuentes de energfa y carbono, respectivamente [145,210].
4,3 Genetica de la fijacion del nitrogeno
El estudio de la gent^tica de la fijacidn de nitrdgeno se inicid en Klebsiella pneumoniae, en la que
se ban identitlcado al menos 21 genes /?//que controlan el proceso. Estos genes est^n organizados en ocho
regiones de transcripcidn comprendidas en una porcidn del cromosoma de 23 kb [50]. Los polip^ptidos
estructurales de la nitrogenasa est^n coditlcados por el operdn nifHDK [294,296], mientras que otros
operones regulan funciones diversas: la biosfntesis de FeMo-co est^ controlada por los operones nifBQ,
nifEN y nifK [172,296,325], la modificacidn post-traduccional de los componentes de la nitrogenasa es
llevada a cabo por proteinas codificadas en el operdn nifUSVM [294-296] y las protefnas transportadoras
de electrones est^n codificadas en los operones nifF y nifJ [154,296,337]. Por ultimo, el operdn nifAL
regula la transcripcidn del conjunto de genes /?// [91]. Cuando los genes nif (\c K. pneumoniae son
transferidos a otras bacterias como Escherichia coli [77], Salmonella ryphimurium [278], Agrobacterium
tumefaciens [74,75] o mutantes Nif de Azotobacter vinelandii [49] o de Rhizobium [75], la bacteria
72
recepiora se hace diazotrota y la expresii'in de los genes nifes,ii sometida a represic'in por el niir(5geno tljado
o por el oxfgeno.
Cuando se \ogr6 la clonaci(5n de los genes /:// de K. pneumoniae en pllsmidos, se abri(3 la
posibilidad de investigar la presencia de genes similares en otros diazoirofos. mediante t^cnicas de
hibridacii5n de ADN que han puesto de manifiesio la existencia de genes /2//aliamenie conservados en todos
los diazoirofos invesiigados hasta ahora, sobre lodo en los que se retlere al operdn niJHDK, \o que indica
un notable grado de conservacii3n en la estructura de la niirogenasa. pese a que los diazotrotbs son un
conjunio filogeni^tico diverso de bacterias [224.308]. En algunos, los genes /;// son de localizaci6n
cromos(3mica, pero en otros, como Rhizobium, Lignobaaer o Enierobaaer agglomerans. se encuentran en
pl^midos [252]. Algunos autores encuentran la explicacion del alto grado de conservacicin de los genes
de la nitrogena.sa precisamente en esta local izacitln plasmidica de los genes /;//. Para ellos. en muchos
diazotrotos la capacidad tljadora seri'a de adquisici6n reciente mediante una transt'erencia horizontal de
genes. Sin embargo, .si ello hubiera sido asi, tambi^n cabri'a esperar un alto grado de homologia en genes
////diterentes de los estructurales de la nitrogenasa y, como queda dicho, el mayor grado de homoiogfa se
encuentra en el operi'in nifHDK. En nuestra opinii3n. cabe una explicacidn alternaiiva: la rijacii3n del
dinitrdgeno debe ser una actividad de aparici6n temprana en el curso de la evoluci(3n, como lo sugiere la
existencia de arqueobacterias diazotrofas y la extremada sensibilidad al oxfgeno de la nitrogenasa. Quizes
la actividad de la enzima sea muy dependiente de las estructuras secundaria y lerciaria de sus componenies
y, por ello. sean permisibles muy pocos cambios en la secuencia de amino^cidos [39].
Dado que la nitrogenasa es uno de los principales constituyenies celulares de los diazotrotbs (puede
llegar a suponer el quince por ciento de la protefna celular soluble) y que su actividad catalitica es
extremadamente costosa en i^rminos de .ATP consumido, no resulta extrafio que en todos los sisiemas
tljadores de nitrt^igeno la tiincii'in de los genes /2//est^ sometida a una estricta regulacii'in para evitar que.
por un exceso en el medio Je nitriigeno combinado o de oxfgeno. el proceso se haga supertluo por la talta
de eficacia o por inactivacii'in de la nitrogenasa [257]. Asf, en presencia de oxfgeno o de una fuente de
nitr(5geno combinado abundante se reprime la sfntesis de la enzima [89,361]. En A.', pneumoniae los
diferentes operones /iz/consiituyen un regulOin, sujeto a control positivo (activacion) y negativo (represi(5n).
Ambos tipos de control se ejercen a dos niveles jer^rquicos diferentes. El primero de ellos estd ejercido
por el sistema Ntr (regulaci(5n general del meiabolismo del nitr(3geno) que afecia no s6\o a los genes nif.
sino tambi(^n a otros operones del metabolismo del niir(5geno. como los de la utilizacii^n de la arginina. la
histidina o la prolina [219] y el otro, a cargo del operi'in nijLA, es especitlco para los operones nif.
El sistema Ntr est:i formado por tres genes: turA que coditlca un factor sigma ((T*"), diferente del
factor a^ convencional. que es necesario para la transcripcic')n especftlca de los operones sometidos a
73
control por Ntr; la si'ntesis de esta protei'na es constitutiva y no se at'ecta por la fuente de nitr6geno ni per
la presencia de oxfgeno [157.238]. El gen nirB codifica para una protein-quinasa que fostbrila de manera
especiTica al producto de lUrC y este gen codifica una protefna que activa al promoter del oper6n niJLA.
La activaci6n de los genes /z//de K. pneumoniae tiene lugar en cascada, como se expone en la figura 4.
ntrA
54 o
genes nif
-o:
^+
t
o
nifA nifL
gInB gInD
uridiiada
i
o
oxigeno L_^^
t +
—
o
T2
?-t;? • t •
ginA ' ntrB ntrC
Fij»ura 4. Regulacion de los genes nif en K. pneumoniae. Los promotores dependientes de o^ se representan con
trama oscura y los dependientes de cr* (protei'na del gen nfrA), rayados. Los cuadrados representan las formas
inactivas de las proteinas y los circulos, las formas activas. La h'nea gruesa de trazo continuo indica induccion; la
punteada, represion; la Imea de trazo discontinuo, catalisis.
En condiciones limitantes de nitr(3geno comhinado, cuando la relaci(5n a-cetoglutarato/glutamina
alcanza un valor crftico, el producto del gen ^InD activa por uridilacic'in al producto del gen glnB y este
producto activa NtrC mediante la quinasa NtrB. La protei'na NtrC tbst'orilada, en conjunci6n con la protefna
NtrA, activa al gen estructural de la glutamin-sintetasa iglnA) y al oper^n niJLA. Adem^s, como glnA, ntrB
y /zrrC constituyen un linico oper6n, aumentan las concentraciones de NtrB y NtrC. El producto del gen
nifA^ junto con NtrA activa la transcripci^n de los restantes genes nif. En presencia de nitr6geno fljado no
hay aciivaci6n de la protefna GlnB y, por consiguiente, tampoco de NtrB ni de NtrC. Estos productos
gtJnicos inactivos reprimen la expresi6n de sus propios genes a partir del promoter de glnA [257]. La
represion por el oxigeno se efectiia por un mecanismo diferente, que no depende del sistema nir, yd que
algunos de los operones regulados por este sistema han de expresarse en condiciones de aerobiosis [76,89].
74
En este caso la represic^n depende exclusivamenie del producio NitL que. en presencia de alias tensiones
de oxfgeni) se modifica e mactiva al producio NifA 1155.238].
En el caso de los rizobios, la organizaci(3n de los genes nif y su regulaci6n son diferentes. For
ejemplo, los genes estructurales de la niirogenasa, nifHDK, torman un solo oper(3n, localizado en el
pl^smido pSym, en R. meUloti y R. leguminosarum, pero en B.japonicum esidn separados en dos operones
diferentes, niJH y niJDK, de localizaci6n cromos(3mica [214]. For otra parte, en estos diazotrotbs
simbi6ticos se ban enconirado otros genes para la fijaci(3n del dinitr6geno, que no son homc^logos con los
de K. pneumoniae y que reciben el nombre de genes yf,r. Aunque en la mayor parte de los casos no se ha
identificado aun la t'unci^n bioquimica exacta de los genes yic, las secuencias de nucle6tidos de algunos de
ellos guardan homologfa con las de los genes de las ferredoxinas bacterianas y otras metaloprotefnas
[136,92.93.152,195,247]. La regulaci6n de los genes de la tljaci^n tambit^n es diterente en los rizobios:
el gen nifA es activado a trav6s de una cascada que se desencadena cuando los niveles de oxi'geno del medio
caen por debajo de cierto umbral. En estas condiciones, la protefna FixL, local izada en la membrana actiia
como sensor de oxfgeno, se autotbstbrila y transtlere el grupo tosfato a una protefna reguladora. Fix J
[62,274]. La protefna FixJ fostbrilada induce la transcripci(3n de nifA y 6e fixK. El producto NifA. junto
con el factor sigma NtrA, enciende los restantes genes nify fix. Por otra parte, la propia protefna NifA es
sensible al oxfgeno [22] y representa por ello un segundo nivel de regulaci6n de los genes nify fix.
5. Fisioloj^fa del nodulo radical
5.1 Intercambio gaseoso
Para que en el nodulo radical, una vez formado. se Ueve a cabo una tljacic'in de nitrc'igeno etlcaz
es necesario que se cumplan una serie de condiciones, que ban sido revisadas [382.383] y que se pueden
resumir en las tres siguientes:
a) debe existir una barrera de difusic^^n para el oxfgeno que equilibre su entrada con el consumo en
el interior del nodulo.
b) una tasa respiratoria relativamente aha en la c^lula infectada a tin de que se produzca una cafda
relativamente r^pida en la concentraci6n de oxfgeno disuelto.
c) una red de espacios a^reos interconectados entre las ct^lulas infectadas. Como el oxfgeno difunde
una diez mil veces mejor en el aire que en medio acuoso. la presencia de estos espacios permite un riipido
movimiento del gas por la zona infectada, de tal forma que scMo penetra en la cc^lula una pequeiia fraccic3n.
De no existir estos espacios. el centro del ni.'idulo serfa absolutamente anaerobio. La leghemoglobina
75
existente en el citosol de la ct^iula infectada completa el tlujo del oxfgeno hasta la superficie del bacteroide.
Estos mecanismos protectores no dehen impedir ni la entrada de nitr^geno ni la salida de CO.,
procedente de la actividad respiratoria, o de H., procedente de la actividad nitrogenasa. El aporie de
nitrdgeno se asegura merced a su elevada concentraci6n en el aire atmostt^rico y a la gran capacidad del
bacteroide para reducirlo hasta NH3, lo que permite la formacidn de un gradiente de concentraci6n
sutlciente para que pueda difundir hasta el interior del tejido nodular [16]. Por el contrario, la difusi(5n
hacia el exterior del CO. y del H. es m^s compleja, ya que en ambos casos se deben establecer gradientes
lo sutlcientemente amplios como para permitir que estos gases difundan hacia fuera con la misma velocidad
en que son generados como consecuencia de la actividad metab61ica de la c^lula infectada. El CO. se
encuentra en equilibrio con su forma hidratada, el ion HCOv, que difunde en medio acuoso mucho m^s
rdpidamente que el CO., aunque a travt^s de las membranas lo haga mis lentamente. debido a la existencia
de una carga negativa. En medio acuoso, la reacci6n de hidrataci6n del CO. es lenta, pero en los n(3dulos
existe la enzim.a anhidrasa carb6nica, que cataliza la formacitin de HCO/ y hace que la velocidad de
difusir)n del CO. no se vea limitada por la de su hidrataci6n, sino por la magnitud del gradiente de HCO;,"
tormado. Por otra parte, al evitarse la acumulaci^n de CO., se favorece el funcionamiento de la
leghemoglobina, ya que la afinidad de esta protei'na por el oxfgeno disminuye en presencia de CO. [16].
En lo referente al H., su velocidad de difusi6n es mucho mayor que la del oxfgeno y, por ello, aunque no
se establezcan grandes gradientes, es posible que difunda hacia fuera sin que llegue a acumularse en el
nodulo a concentraciones que inhiban a la nitrogenasa. Ademds, debe recordarse la existencia en los
bacteroides de muchos rizobios del sistema Hup que reciclarfa el hidrc3geno haciendo innecesaria su salida
al exterior nodular.
5.2 Metabolismo del carbono
Debido a la mayor facilidad para su aislamiento, los simbiosomas del sistema Bradyrhizobium
Japonicum-so'yd han sido los m^s estudiados desde este punto de vista y, por ello, la discusidn que sigue
estar^ centrada fundamentalmente en t^l, aunque, cuando se disponga de datos sobre otras simbiosis, se har^
menci^n de ellos. Ya se ha indicado que el funcionamiento de la nitrogenasa requiere electrones y energia.
Se admite que la fuente principal de ambos requerimientos es el fotosintato de la planta. ya que la falta de
fotosintato, impuesta experimentalmente cultivando a la planta en oscuridad. tiene como consecuencia una
disminucion en la tasa de tljacion de nitrdgeno [372]. El fotosintato es metabolizado en las ct^lulas del
nddulo para producir el poder reductor necesario para reducir a la ferredoxina, reductor inmediato de la
nitrogenasa reductasa, y el ATP necesario para la accidn de esta ultima. Tambit^n se ha indicado que la
76
c^lula intectada est^ compariimeniada y que el bacteroide se encuentra (solo o tormando grupos en niimero
variable) en el interior del simbiosoma. org^nulo delimitado por una membrana que recibe el nombre de
membrana peribacteroidea. Por consiguiente, la discusi(3n del metabolismo del carbono debe hacerse
teniendo en cuenta esia compartimeniacii^n de la c<^lula.
5.2.1. Metabolismo en el citosol
El principal producto de la totosmtesis translocado al n6dulo es la sacarosa [288] pero no es
probable que actue como tuente primaria de energfa para los bacteroides. ya que la velocidad de enirada
a trav«Js de su membrana es muy baja [127] y no se ha detectado en ellos invertasa, enzima que caializa
la hidrolisisde la sacarosa en glucosa y fructosa [222.341]. Por otra parte, aunque en el citosol de la planta
intectada existe invertasa [341]. la entrada de glucosa en el bacteroide se inhibe por la presencia de ^cidos
dicarboxflicos como el succinato o el malato que tambic^n se detectan en el citosol [314.342]. Por
consiguiente, los hidratos de carbono ban de ser metabolizados en el citosol para rendir compuestos que
puedan atravesar la membrana peribacteroidea y la del bacteroide.
Gran parte de la sacarosa que llega al ne5dulo es almacenada en el citosol de las c^Jlulas infectadas
en forma de almidO)n [164,375]. lo que retleja un exceso de aporte de sacarosa para suplir los
requerimientos de la tljacii.'in del nitriigeno. ya que la acumulaci^n de almidOin es considerada generalmente
como consecuencia de un exceso de carbohidratos. En cualquier caso, parte de la sacarosa importada al
n6dulo es hidrolizada por la invertasa del citosol en glucosa y fructosa, que son metabolizadas por la
glucolisis mediante la vi'a de las pentosas fosfato [16]. Es casi un paradigma, derivado de los estudios con
celulas animales. que la glucolisis rinde piruvato que luego es importado a la mitocondria donde es
convertido en acetil-CoA y metabolizado a iraves del ciclo de los dcidos tricarboxilicos (TCA). Sin
embargo, en las celulas infectadas el niimero de mitocondrias es muy pequeiio en relacion con el de
bacteroides, por lo que no parece probable que la actividad mitocondrial sea sutlciente como para
suministrar todo el ATP necesario para la actividad de la nitrogenasa. Por otra parte, debe ser tenido en
cuenta que en las condiciones microer6fllas del ne'idulo es posible que el ciclo TCA mitocondrial no actiie
ya que algunas de sus enzimas. como la citrato sintasa, la NADP-isocitrato dehidrogenasa y la a-cetoglutarato
dehidrogenasa, se inhiben o se reprimen en estas condiciones [226]. Por consiguiente, debe
ser considerada otra via alternativa en la que la glucolisis rinde malato y que en las c<^lulas vegetales en
general puede tener una importancia cuantitativa. al menos. similar a la considerada "cllsica", es decir,
glucolisis, ciclo TCA, cadena respiraioria [63,202]. En estas c^^lulas existen dos enzimas, la fosfoenolpiru-vato
carboxilasa y la malato dehidrogenasa que catalizan la conversion del oxalacetato en malato [202]. La
77
enzima millica. tamhit^n presente en el citosol produciri'a piruvato a partir del malato, lo que, a su vez,
constituye una fuente adicional de piruvato y CO., susiratos de la tbstbenolpiruvato carboxilasa. Por otra
parte, es tambitin posible que el malato no sea el linico compuesto ^cido producido en el citosol, ya que
en condiciones de baja tensi6n de oxfgeno se producen tambi(^n dcidos dicarboxflicos C4, como el succinate
el fumarato [63, 139,203]. El an^lisis de los ^cidos org^nicos presentes en los n6dulos, tanto determinados
como indeterminados, parece indicar la existencia en las c^lulas infectadas de una vfa reductora para la
sfntesis de dicarboxilatos C4 [371]. En cualquier caso, los dicarboxilatos m^s abundantes en el n6dulo son
el malato y el succinate. Por otra parte, los an^lisis de actividades enzim^ticas en el citosol, demuestran
cantidades muy elevadas de proteinas y de actividades tbstbenolpiruvato carboxilasa, malato dehidrogenasa
y aspartate aminotransferasa [54,85,96,120,200,344,376] que son las enzima claves para dirigir el tlujo
del carbono hacia la produccidn de malato [139.231.369]. Por otra parte, en n6dulos ineficaces o de plantas
sometidas a determinados tratamientos, como la adici6n de nitrates, la eliminacidn de los retonos en
presencia de inhibidores, se produce una cafda paralela en la concentraciOn de dcidos orgiinicos, en las
actividades de estas tres enzimas y en la actividad nitrogenasa [96,320,370]. Lo que permite sugerir que
es el malato el compuesto carbonado que, principalmente soporta la actividad de la nitrogenasa.
5.2.2. Tran.sporte a traves de la membrana peribacteroidea
Come ya se ha indicado, los bactereides se encuentran encerrades en org^nulos especiTicos, los
simbiosomas, que est^n delimitades per una membrana que recibe el nombre de membrana peribacteroi-dea.
Cada vez son mis abundantes los datos que sugieren que la tbrmacidn de la membrana peribacteroidea
no es una mera censecuencia de la internalizacidn de la membrana citeplasmdtica de la C(^lula intectada.
Asf, se ha cemprobade que se trata de una membrana con una alta properci6n li'pidos:pretefnas [300] y que
contiene fosfatidilcolina, que es sintetizada en el reticule endepl^smico y transpertada por el sistema de
Golgi de la c^lula intectada [234]. De igual forma, contiene glicoproteinas especiTicas que son precesadas
en el retfculo endepl^smice y en el sistema de Golgi e en ambes compartimentos [377,378]. Por otra parte,
las comparaciones de los pertlles proieices obtenides per electroforesis en geles de poliacrialmida y per
inmunoelectroforesis demuestran la falta de identidad entre la membrana peribacteroidea y la citeplasm^tica
[236]. Por ijltimo, la membrana peribacteroidea posee una ATPasa [25,81] que puede generar un petencial
de membrana en el simbiosema intacto [363].
Entre las proteinas que tbrman parte de la membrana peribacteroidea se encuentran las que regulan
el pase de metabolites entre el citosol de la c^lula intectada y el bacteroide. Adem^s de la ATPasa que
hemes mencionade, contiene una pretein-quinasa dependiente de ienes calcie, que interviene en la
78
regulaci^n del transporte de meiabolitos. ya que se admite que la t'ost'orilacic')n de proteinas estimula la tasa
de transporte de malato a trav^s de la memhrana peribacteroidea, representando un importante mecanismo
regulador durante la tljacion del nitn'igeno [2601. Por consiguiente, la memhrana peribacteroidea no es s6lo
un sistema de aislamiento del bacteroide y del citosol celular. sino que se trata de un centro metab(3lico muy
activo que conirola el funcionamiento de la simbiosis.
De los compuestos carbonados que se encuentran en el citosol de la ci^lula intectada, los m^s
abundantes son los carbohidratos, los dcidos dicarboxilicos y el glutamato [73.181]. De ellos, la sacarosa,
la glucosa y la tVuctosa no pueden atravesar la membrana peribacteroidea [65.316). En realidad. se detecta
una cierto paso de glucosa y de truciosa a travt^s de dicha memhrana, pero su velocidad es muy lenta [362]
y no muestra saturacic^n por sustrato [365]. lo que sugiere que se trata de un proceso de difusi6n pasiva
y no de un transporte mediado por transportador [65]. Un disac^rido que se encuentra en grandes
cantidades en el simhiosoma y tambi(^n en el citosol de la C(^lula intectada es la trehalosa. Como se acaba
de comentar, la memhrana peribacteroidea carece de transportadores para la glucosa. pero si' puede
transportar UDP-glucosa [313]. que puede provenir de la sacarosa presente en el citosol mediante la
reaccit'in reversible de la sacarosa sintetasa, enzima muy abundante en las ct^lulas del n^dulo [242]. Dado
que el bacteroide coniiene enzimas tbsforilantes de la glucosa y de la fructosa. se puede sintetizar en 6\ la
trehalosa. que luego se puede hidrolizar por una trehalasa presente tamo en el citosol de la ct^lula intectada
como en el espacio perihacteroideo [232]. Adem^s. los bacteroides de B. japonicum contienen dos enzimas
capaces de hidrolizar la trehalosa: la fostbtrehalasa. que produce glucosa-6-tbsfato y glucosa. y la trehalosa
tbstbrilasa, que rinde glucosa- 1-tbstato y glucosa [311]. El resultado tlnal de este sistema serfa el transporte
de glucosa a trav^s de una memhrana inicialmente impermeable a ella [55]. Todavfa no se dispone de
intbrmacion sutlciente acerca de algun otro papel que la trehalosa pudiera desempeiiar en el funcionamiento
de la simbiosis.
De cualquier Ibrma. los carbohidratos deben ser poco relevantes para el mantenimiento de la
actividad tljadora de nitrt'igeno y no constituyen una fuente de energfa directa para el bacteroide. como lo
sugiere el hecho de que las enzimas claves de la vi'a de Embden-Meyerhof (la tbstbt'ructoquinasa), de la
vfa oxidativa de las pentosas fosfato (la 6-fostogluconato dehidrogenasa) o de Entner-Doudoroff(la glucosa-
6-fosfato dehidrogenasa) no se detecten en el bacteroide. o bien sus actividades sean mfnimas y desde luego
mucho menores que las que presenta la bacteria en vida libre [173.316.317]. Por otra parte, mutantes de
Rhizohium detlcientes en algunas de las enzimas del metabolismo de la hexosas, como la glucoquinasa. la
tbstbgluco-isomerasa. la tructoquinasa o la piruvato dehidrogenasa, torman n^dulos etlcaces (capaces de
tljar el nitrc'igeno) en la leguminosa hospedadora especiTica [16].
La hip^tesis de que el glutamato serfa un sustrato carbonado ideal durante la tljacic'in del nitr6geno
79
[181] hizo centrar la atenci(5n en el transporte de este aminodcido a travt^s de la memhrana peribacteroidea.
Sin embargo, se demostr^ que, si bien los bacteroides aislados captan el amino^cido por un mecanismo
mediado por transportador que, adem^s es dependienie de la fuerza prot6nmotriz del bacteroide, la
. membrana peribacteroidea es impermeable a t^l [367], por lo que tampoco debe ser relevante en el
funcionamiento de la actividad fijadora de niirc3geno en el n6dulo.
Por el contrario, el transporte de dcidos org^nicos, especialmente malato y succinato, es muy
r^pido, tanto por los bacteroides como a travt^s de la membrana peribacteroidea, se inhibe por agentes
desacoplantes y por inhibidores de la respiraci6n, y muestra cin^tica de saturaci6n [367]. Adem^s, los
sistemas de transporte a trav(5s de la membrana peribacteroidea y de entrada en el bacteroide deben ser
diferentes, ya que el primero es sensible a los ^cidos ttal6nico y cianocin^mico. mientras que el segundo,
no [366]. El de la membrana peribacteroidea tiene menor atlnidad por el malato y el succinato que el del
bacteroide, pero las V^, de ambos sistemas son similares. El primero es linico y cataliza el transporte de
una gama relativamente amplia de dicarboxilatos y tiene mayor atlnidad por el succinato y el malato.
Adem^s, el transporte de estos dcidos se inhibe por la carbonilcianuro An-clorofenil hidrazona (CCCP), un
agente desacoplante y por el KCN, un inhibidor del transporte de electrones respiratorio y se estimula por
el ATP [259], lo que demuestra que es dependiente de un estado energc^tico de la memhrana peribacteroi-dea.
Probablemente, este transportador de dicarboxilatos existente en la membrana peribacteroidea sea una
linica molt^cula de protei'na, la denominada nodulina 26 [260].
Parece probado, pues, que los linicos sustratos carbonados que atraviesan la membrana
peribacteroidea a una tasa sutlciente como para soportar la actividad de la nitrogenasa son los
dicarboxilatos, especialmente el succinato y el malato.
5.2.3. Metabolismo en el bacteroide
El hecho de que el malato sea el dicarboxilato m^s abundante en el citosol de la c^lula infectada
y de que pueda atravesar rdpida y etlcazmente la membrana peribacteroidea, asi como la inexistencia en
los bacteroides de las enzimas claves del metabolismo de las hexosas, convirtieron a este compuesto en el
metabolito clave en el interior del bacteroide. Para su metabolismo es necesaria la presencia de un ciclo
TCA etlcaz, como lo pruehan el hecho de que los rizobios mutantes en el transp(.)rte de dicarboxilatos
forman n6dulos inetlcaces [6,34, 107, 126,253,304] al igual que las estirpes mutantes defectivas en alguna
enzima del ciclo TCA [87,122|. Por otra parte, en todos los casos estudiados hasta ahora las actividades
especiTicas de las enzimas del ciclo TCA son mucho m^s elevadas que las de las restantes enzimas del
metabolismo del carbono, tanto en el estado de bacteroide [173] como de ct^lula vegetativa [173,208].
80
La entrada de los dicarboxilatos en el bacteroide se efectiia a iravtJs de un iransportador (el sisiema
dtc) que se ha descrito tamo en Rhizobium [34,107.304] como en Bradyrhizobium (168). Kahn y col. [181]
sugirieron que la entrada de malato se verfa favorecida, adem^, por la dencminada lanzadera malato-aspartato.
De acuerdo con estos autores, el malato imponado por los bacteroides seria oxidado hasta
oxalacetato por la malato dehidrogenasa y luego transaminado hasta aspartato por una aspanato
aminotransferasa dependiente de glutamato, rindiendo aspartato y a-cetoglutarato que serfan exportados al
citosol de la ciJlula infectada. Esta afirmaci(3n estaba basada en el hecho de que en los bacteroides de B.
japonicum existen cantidades importantes de la aspanato aminotransferasa [200,309]. La salida de or-cetoglutarato
del bacteroide hacia el citosol celular mantendrfa el potencial electroqufmico a trav6s de la
membrana del bacteroide a fin de compensar en parte la captaci(5n de malato. En apoyo adicional de esta
interpretaci6n est^ el hecho de que cuando los bacteroides de soja aislados son incubados en presencia de
glutamato marcado con "C y malato trfo, en la mezcla de reacci(3n se acumula a-cetoglutarato marcado
con '^C. [343]. Ahora bien, para que continue el tlujo de compuestos carbonados entre el citosol celular
y el bacteroide seria necesario que en el citosol el a-cetoglutarato fuera transaminado con aspartato por
acci6n de la aspartato aminotransferasa del vegetal, para producir glutamato y oxalacetato. Este ultimo serfa
reducido luego a malato por la m^lico dehidrogenasa y podrfa entrar de nuevo en el simbiosoma. Pero el
funcionamiento de la lanzadera exige la entrada de glutamato que donarfa los grupos amino para la
transaminaci(3n inicial del oxalacetato por la aspartate aminotransferasa del bacteroide. Esta entrada de
glutamato es posible a trav<Js de la membrana del bacteroide [21,312,367], pero ya hemos visto cdmo la
membrana peribacteroidea es una barrera de permeabilidad para el glutamato [367], por lo que esta
lanzadera no parece estar implicada en el intercambio de metabolitos entre el citosol y el bacteroide.
Una vez en el interior del bacteroide, el malato es metabolizado mediante un complejo sistema que
implica al ciclo TCA, al ciclo de los dcidos dicarboxflicos (DCA), la sintesis de poli-fi-hidroxibutirato y,
en cierta medida, la fermentaci6n del piruvato. A continuaci(5n veremos cada una de estas vfas metab(51icas:
5.2.3.1. El ciclo TCA
Dado el significado metabcllico del ciclo TCA en los bacteroides, se hace necesario comentar su
funci6n y los mecanismos de regulaciCin del mismo que operan en la simbiosis. Como en otros organismos
heterotrofos las funciones b^sicas del ciclo TCA son suministrar precursores biosint^ticos y, acoplado con
la cadena respiratoria, generar la mayor parte del ATP necesarios para el crecimiento o para las reacciones
enderg6nicas que tienen lugar en el bacteroide. Tambi<^n como en los restantes organismos. el ciclo es
cebado con acetil-CoA que se combina con el oxalacetato para formar citrato. compuesto de seis ^tomos
81
de carbono que experimenta cuatro reacciones de oxidaci(3n, dos de las cuales (las catalizadas por la
isocitrato dehidrogenasa y por la a-cetoglutarato dehidrogenasa) son tambi^n reacciones de descarboxila-ci6n,
de tal forma que se eliminan los dos dtomos de carbono correspond ientes al acetil-CoA y se regenera
el aceptor de cuatro carbonos, el oxalacetato. Los dos compuestos iniciadores del ciclo, el oxalacetato y
el acetii-CoA, provienen del malato importado desde el citosol celular. El oxalacetato puede ser formado
por la reacci(5n catalizada por la mdlico dehidrogenasa y el acetil-CoA se formarfa a partir del oxalacetato
por una serie de reacciones anaplerdticas, cuya naturaleza exacta aun no es clara, ya que, en realidad, son
posibles varias rutas. En los bacteroides de B. japonicum no parece existir la fosfoenolpiruvato carboxilasa
[344], que es la enzima que cataliza la carboxilaci6n del fosfoenolpiruvato, un intermediario de la
glucolisis, hasta oxalacetato, pero son posibles otras vfas allernativas. Una de ellas implicarfa la reducci6n
del malato hasta oxalacetato por la m^lico dehidrogenasa, seguida por la reacci6n catalizada por la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa que descarboxila el oxalacetato hasta fosfoenolpiruvico y que ha sido
detectada en los bacteroides, pero parece no ser esencial para el funcionamiento del n6dulo [227]. La
conversidn del fosfoenolpiruvato hasta piruvato estarfa catalizada por la piruvatoquinasa, enzima que
tambitJn ha sido detectada en los bacteroides [200]. Otra alternativa implica a la enzima m^lica (malato
dehidrogenasa descarboxilante) que rinde piruvato y CO;. Esta enzima ha sido detectada en los bacteroides
de B. japonicum [199] y parece desempenar un significative papel en la oxidaci6n de los ^cidos
dicarboxflicos [228]. Vemos, pues, que cualquiera de las vfas posibles utiliza como intermediario al
piruvato que luego serfa descarboxilado hasta acetil-CoA, que tendrfa diversos destinos: cebar al ciclo TCA,
entrar en el ciclo DCA, ser usado en la producci6n de PHB o reducirse hasta etanol vi'a acetaldehido [226].
Con respecto a la regulacidn del ciclo TCA en los bacteroides de los rizobios se dispone de poca
informaci6n, ya que han sido pocas las enzimas aisladas y caracterizadas. Waters y col. [376] aislaron la
m^lico dehidrogenasa de B. japonicum que es sensible a varies metabolitos efectores, entre los que se
encuentra el NADPH [98]. La isocitrico dehidrogenasa de R. meliloti es sensible al ATP y en menor
medida al ADP y al AMP [57]. En rizobios infectives en Lotus se encuentra una isocitrico dehidrogenasa
dependiente de NAD que en la bacteria en forma libre es sensible al ATP, mientras que en el bacteroide
no responde a los nucleotides de adenina [246], le que sugiere que esta actividad radica en enzimas
diferentes en la bacteria en forma libre y en el bacteroide. Recientemenie [221] se ha descrito que en
Bradyrhizobium (Lupinus) la actividad malice dehidrogenasa radica en una enzima en la forma libre de la
bacteria y en dos, en el bacteroide. En B. japonicum la piruvato dehidrogenasa se inhibe per el NADH
[97].
Un hecho que debe ser tenide en cuenta es que el ciclo TCA se encuentra, en la mayoria de los
organismes, regulade por el oxfgeno. Asf, la isocitrato dehidrogenasa y la a-ceteglutarate dehidrogenasa,
82
las dos enzimas descarboxilanies del cicio, asf como la citralo sintasa, suelen ser sensibles al NAD(P)H y
su expresidn y actividad se inhiben en condiciones anaerobias en las que se produce una elevaci6n de la
proporcidn NADH/NAD [174,323]. Dado que en el n6dulo existe un ambiente microaer^filo se ha
cuestionado si la rama descarboxilante del cicIo TCA desempena realmente un papel importanle en el
metabolismo del bacteroide y en la fijaci(3n del nitrdgeno (226]. Recientemente se ban aislados mutantes
de R. meliloti carentes del gen estructural de la isocftrico dehidrogenasa {idc). Esios mutantes forman el
mismo numero de n6dulos que la estirpe silvestre y con forma y tamano normales, pero inetlcaces y,
adem^s, carentes de leghemoglobina. A partir de estos mutantes fueron aislados pseudorevertientes, carentes
de actividad cilrato sintasa, que s61o tbrmaban n^dulos rudimentarius [180]. Estos resultados sugieren que
las enzimas del ciclo TCA pueden intervenir no st'ilo en la funci^n del nt'idulo, sino tambi^n en su
mortbgtJnesis [180].
5.2.3.2. El ciclo DCA
De todas formas, la rama descarboxilante del ciclo TCA tampoco resulta imprescindible, en
t(Jrminos metab(51icos, para el funcionamiento del n(5dulo, ya que la regeneraci6n del oxalacetato puede
producirse mediante la operacitin del ciclo de los dcidos dicarboxilicos (DCA). Este es un ciclo que liene
dos enzimas clave: la isocitrato liasa, que cataliza la escisi6n del isocitraio en succinato y glioxilato, y la
malato sintasa, que cataliza la condensacicin del glioxilato con el acetil-CoA para dar malato. Ambas
enzimas ban sido detectadas en los bacteroides de B. japonicum [313].
5.2.3.3. El ciclo del ^cido r-aminobutfrico (GABA)
Otra via que obvia una de las reacciones descarboxilantes del ciclo TCA es la via del GABA, que
partiendo del a-cetoglutarato rinde succinato, a trav^s de la producci6n de glutamaio, GABA y succinato
semialdehido. Para el funcionamiento de esta vfa es necesaria, primero, la aminacic>n de a-cetoglutarato
hasta glutamato. Salminen y Streeter [312] ban demostrado que una parte significativadel carbono que entra
en el ciclo TCA es convertido en glutamato y Fottrell y Mooney [112] demostraron que el amonio y el a-cetoglutarato
inducen muy etlcazmente la cetoglutarato dehidrogenasa y la aspartato aminotransferasa. En
los bacteroides el amonio debe ser abundante debido a la accicln de la nitrogenasa y, si debido al ambiente
microaer^tllo, se inhibe o se reprime la a-cetoglutarato dehidrogenasa, podrfa producirse tambi<^n una
acumulacic'in del ceto^cido, por lo que es posible la formacit^n de glutamato por aminacic)n del a-cetoglutarato.
El glutamato formado podrfa cumplir una primera funcic'in consistente en donar los grupos
83
amino para el funcionamiento de la lanzadera malato-aspartato, ya comentada, pero tambi6n podrfa ser
descarboxilado para formar GABA que se produce muy abundantemente en el n6dulo [45,203] y que luego
serfa desaminado y oxidado hasta succinate [181,226]. Esta via seria un procedimiento para retirar a-cetoglutarato
del ciclo TCA obviando la acci(3n de la a-cetoglutarato dehidrogenasa, pero eliminando una
cantidad equivalente de COj y rindiendo succinato, otro intermediario del ciclo.
Para que la vfa opere es necesaria, como queda dicho, la aminaci6n del a-cetoglutarato hasta
glutamato, que puede estar catalizada por dos sistemas enzim^ticos diferentes, la glutamato dehidrogenasa
la glutamina:2-oxoglutarato aminotransferasa (GOGAT) y ambas han sido detectadas en los bacteroides
de B. japonicum [40,86], por lo que resulta muy probable la existencia de esta vfa. Es m^s, se ha sugerido
que en los bacteroides de B. japonicum puede ser la principal vfa catab61ica para el glutamato [199] y se
han aislado mutantes de R. meliloti defectives en esta vfa, que si bien forman n(5dulos de apariencia normal
tienen menor actividad nitrogenasa [111].
5.2.3.4. Metabolismo del piruvato
Ya hemos visto C(3mo el piruvato sirve de metabolito cebador de los ciclos TCA y DCA mediante
su descarboxilacidn a acetil-CoA. Sin embargo, en las condiciones microaer6filas del n6dulo son posibles
vfas fermentativas para la transformaci6n de este metabolito. Una de ellas serfa su conversion en alanina
por la alanina dehidrogenasa [16], aunque esta enzima no se encuentra en los n6dulos de alfalfa y las altas
concentraciones de este amino^cido existentes en los bacteroides debe ser atribuida a la actividad de la
glutamato:piruvato aminotransferasa [85]. Existe tambit^n la posibilidad de que el piruvato sea reducido a
lactato por la lactato dehidrogenasa, ya que esta enzima ha sido detectada en los nddulos de alfalfa [85] y
los bacteroides de soja incubados en condiciones microaerOfilas acumulan lactato [346].
En los bacteroides de B. japonicum se han detectado las actividades aldehido dehidrogenasa [344]
y alcohol dehidrogenasa [313]; adem^s, en condiciones anaerobias la alcohol dehidrogenasa procedente de
extractos de bacteroide favorece la producci6n de etanol [347] y, dado que los bacteroides forman acetato
cuando se incuban en anaerobiosis y en ellos no existe piruvato descarboxilasa [347], se puede postular que
el piruvato es descarboxilado a acetil-CoA, que posteriormente se transforma en acetato por la acetil-CoA
sintasa [279]. A continuacidn la acetaldehido dehidrogenasa convertirfa el acetato en acetaldehido y la
alcohol dehidrogenasa completarfa la reducci6n hasta etanol.
84
Los bacteroides de B. japonicum y de R. leguminosarum bv. phaseoU acumulan grandes caniidades
de poIi-B-hidroxibutirato que pueden suponer hasta el 50 por ciento del peso seco y que se pueden poner
de manifiesto mediante microscopia electrdnica [385]. La sfntesis de esie polfmero que comienza cuando
se establecen las condiciones microaer6filas en el n6dulo, se inicia por la condensaci(5n de dos unidades
de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, que se reduce a fi-hidroxibutiril-CoA, cuya polimerizaci6n da
lugar al PHB. se traia, pues, de un proceso reductor. Ahora bien, dado que en condiciones de
microaerotllia la niirogenasa consume grandes cantidades de energfa y de elecirones. es razonable
preguntarse qu6 funciOn cumple en el bacteroide la sfntesis de PHB. McDermon y col. [226] especulan que
en las condiciones microaer6filas del nddulo se acumularfa reductor, es decir, habrfa una alta relaci(5n
NAD(P)H/NAD(P), que inhibirfa o reprimin'a a enzimas tales como la isocitrato dehidrogenasa, la
cetoglutarato dehidrogenasa o la citrato sintasa, lo que provocaria una acumulaci(3n de acetil-CoA que se
derivarfa a la sfntesis de PHB: el proceso, restablecerfa, asfmismo, una relaci6n NADH/NAD favorable
para el funcionamiento de las mencionadas enzimas, que, como ya se ha indicado, resultan clave para la
actividad y el desarrollo del n6dulo (apartado 5.2.3. 1). En efecto, coincidiendo con la sfntesis de PHB se
observa una cafda, aproximadamente del 25 por ciento. en la actividad de NADP-isocitrato dehidrogenasa
[187,344].
Coincidiendo con el inicio de la sfntesis de PHB se ban detectado incrementos de la actividad 13-
hidroxibutirato dehidrogenasa [186.385] y. dado que esta enzima suele intervenir en la degradacidn del
polfmero. su actividad implicarfa un recambio constanie de PHB. pero con una acumulaci6n neta del
polfmero [226].
Hemos de mencionar que no en lodas las simbiosis se produce una acumulaci6n de PHB. Si bien
<Jsta tiene lugar de forma general en los bacteroides de Bradyrhizobium, los de Rhizobium, con la linica
excepci(3n ya citada de R. leguminosarum h\ phaseoli, no acumulan tal polfmero o lo hacen en menor grado
que los bradirizobios. Esto no es m^s que una comprobacic3n adicional de las profundas diferencias
metab(51icas que existen entre los dos g^^neros.
5.3. Metaboiismo nitrogenudo
Como en el caso del metaboiismo del carbono. conviene recordar aqui que las ci^lulas infectadas
que forman parte del n6dulo radical se encuentran compartimentadas y que las diversas transformaciones
que llevan a cabo sobre el nitr6geno tienen lugar en diferentes compartimentos: en el bacteroide tiene lugar
85
la producci6n de amonio, como consecuencia de la actividad catalitica de la nitrogenasa sobre la mol<^cula
de dinitr6geno. Sin embargo, no es 6sta la linica txiente de amonio en el n6dulo, sino que en i^ste tienen
lugar otros procesos productores de amonio. En primer lugar, puede proceder de los nitratos, que llegan
al n6dulo directamente desde el suelo por absorci6n a trav^s de la superficie o desde el xilema de la raiz
a trav^s de conexiones con el sistema vascular del n(5dulos [213]. Estos nitratos son reducidos en el n(5dulo
hasta amonio por acci6n de dos enzimas, la nitrato reductasa y la nitrito reductasa que se encuentran tanto
en el citosol de la ct^lula infectada como en el bacteroide. Por otra parte, en el metabolismo intermediario
del nddulo se producen reacciones de desaminaci6n, de hidrellisis y otras, que acaban rindiendo amonio,
que, junto con el procedente de la reduccidn de los nitratos, sirve para aumentar el contenido de amonio
del n(3dulo radical. Desde hace tiempo es conocido el hecho de que la mayor parte del amonio producido
en los bacteroides pasa al citosol de la ct^lula infectada, donde es asimilado por enzimas del vegetal porque,
aunque los bacteroides tienen las enzimas necesarias para la asimilaci6n del amonio, t^stas se encuentran
reprimidas o en muy baja actividad [24,40,165], por lo que el amonio debe ser excretado r^pidamente. En
etecto, desde hace unos veinticinco anos se sabe que los bacteroides aislados que reducen '-N; liberan al
medio la mayor parte del ['-N]amonio liberado [19] y, de forma similar, los rizobios que, en vida libre,
son inducidos a t1jar activamente el nitr6geno in vitro, tambit^n pierden amonio al medio extracelular
[20,254,360]. Por el contrario, las enzimas equivalentes de la fracci6n vegetal del nddulo se inducen
paralelamente a la actividad de la nitrogenasa y asimilan activamente el amonio producido por t^sia
[28,133,293].
Los rizobios y otras muchas bacterias diazotrofas poseen transportadores de amonio que s6\o se
expresan en condiciones limitantes de nitr^geno [128,129,166,177,254,263]. Sin embargo, ni en las
membranas de los bacteroides ni en la membrana peribacteroidea, se expresan tales transportadores y, por
ello, el amonio atraviesa ambas membranas por difusi^n simple [166,177,254,364], que viene favorecida
por la alta tasa de su asimilaci6n en el citosol de la ci^lula infectada.
Como consecuencia de esta asimilaci6n, se forman en las c^lulas del nc5dulo una serie de
compuestos nitrogenados que son exportados por el xilema [265,266] hasta las partes at^reas de la planta,
donde son utilizados como donadores de nitr(3geno reducido para la sintesis de los compuestos nitrogenados
necesarios para el crecimiento. Como ya se ha indicado, las leguminosas pueden ser divididas en dos
grupos segun el tipo de n(3dulos que presentan y el tipo predominante de compuestos que transportan a
trav<5s del xilema: las exportadores de amidas, que forman nddulos indeterminados y transportan
asparragina, glutamina o metiltJn-glutamina, y las exportadores de ureidos, que forman n6dulos
determinados y transportan alantofna, ^cido alantoico o citrulina [320]. Ahora bien, cualquiera que sea el
tipo de molt^culas que se transporten, antes tiene lugar una asimilaci^n primaria del amonio, que rinde
86
glutamina, por acci(5n de la glutamina sintetasa (GS) y la glutamina 2:oxoglutarato aminotransferasa
(GOGAT), tambit^n denominada glutamato sintasa (28.40). El amonio es incorporado al carbono gamma
del ^cido glutimico, tbrm^ndose la amida correspondiente, la glutamina, en una reacci6n dependienie de
ATP y catalizada por la glutamina sintetasa:
GS
glutamato -i- NH\ + ATP — glutamina + ADP + P,
En apoyo de la intervenci6n de esta enzima est^n los hechos siguientes: 1) utilizando '-N y ''N, se
ha demostrado que el amonio se incoq^ora r^pidamente en forma de glutamina [230], y 2) esta
incorporaci(5n es bloqueada por un inhibidor especffico de la glutamina sintetasa, la metionina sulfomixina
(MSO), que provoca un r^pido incremento en la concentracidn de '^NH/ en el n6dulo [230]. El nitr{5geno
incorporado como grupo amida en la glutamina es seguidamente transferido al carbono 2 del dcido
oxoglut^rico, para formar glutamato. Esta reacci6n, dependiente de nucle6tidos de piridina reducidos. es
catalizada por la GOGAT [230]:
GOGAT
2-oxoglutarato + glutamina -i- NAD(P)H + H* 2 glutamato + NAD(P)*
La intervenci6n de esta enzima tambi<^n se ha puesto de manifiesto mediante el empleo de '-^N y
de inhibidores. en este caso, la azaserina que es un inhibidor de la reacciones de transferencia de grupos
amida [255,368]. Las dos enzimas necesarias para esta asimilacidn primaria del amonio han sido aisladas
y puritlcadas del nddulo [27,56,134,229]. La GS se localiza exclusivamente en el citosol, mientras que la
GOGAT est^ tanto en el citosol como en plastos [1 1,30,328,329]. Ambas se inducen durante el desarrollo
del nc^dulo [10,29,135.298,299.319].
Aunque la glutamina. el primer producto de la asimilacidn del amcnio. se encuentra normalmente
en los exudados del xilema de las leguminosas productoras de amidas, no es. ni mucho menos, el
compuesto mayoritario. Lo es la asparragina [4,190,204,340,385], compuesto m^s soluble y metabdlica-mente
menos activo que la glutamina. De las diversas vfas metabdlicas que existen en los vegetales
superiores para la sfntesis de asparragina, se ha demostrado que la que opera en el n(5dulo radical es la
reacci(5n catalizada por la asparragina sintetasa (AS), enzima que ha sido aislada y purificada de los
extractos de n6dulos de soja [167], requiere ATP y cataliza la siguiente reacci(3n [117]:
AS
glutamina + aspartato + ATP asparragina + glutamato + AMP + PP,
El ^cido asp^rtico necesario para la anterior reacci(5n es generado por acci(5n de la aspanato
87
aminotransterasa (AAT), que como se ha indicado se encuentra ampliamente distribuida en los n(3dulos
radicales de las leguminosas [104.105] y cataliza la siguiente reacci{5n reversible:
AAT
aspartato + 2-oxoglutarato * * glutamato + oxalacetato
En la leguminosa tropical Arachis hypogaea, se ha encontrado un amino^cido no proteico, la amida
4-metil^nglutamina, que puede llegar a suponer hasta el 90 por ciento de los exudados del xilema
[113,114]. El mecanismo de sfntesis de esta amida no est^ claro, porque, si bien se ha aislado de los
cotiledones de cacahueie una metil^nglutamina sintetasa especffica [381], que cataliza una reacci6n similar
a la de la glutamina sintetasa, pero utilizando metil^nglutamina como aceptor y formando AMP y PP'; sin
embargo, hasta ahora no ha sido posible aislar esta enzima de los n6dulos de esta planta.
En el otro grupo de leguminosas, los productos mayoritarios obtenidos como consecuencia de la
actividad fijadora de dinitr6geno no son aminas, sino ureidos. Asf, en las especies de Alnus [239] y de
Casuarina [374] el compuesto nitrogenado m^ abundante en los n6dulos, en las raices, en los tallos, en
las hojas y en el exudado del xilema es la cirulina, cuya procedencia del amonio asimilado en el proceso
fijador se ha demostrado mediante la utilizaci(3n de '^N y '''CO;, que demuestran que ambos marcadores
se incorporan r^pidamente en citrulina, a una tasa muy similar a la de la fijaci6n del dinitr6geno [1 18,225].
Se sabe muy poco sobre la sfntesis de citrulina en los n6dulos, pero en otros tejidos vegetal es este ureido
se forma normalmente mediante una reacci6n entre el carbamil fosfato y la ornitina, que est^ catalizada por
la ornitin carbamil transferasa (OCT):
OCT
carbamil fosfato -l- ornitina citrulina + P,
Ahora bien, como la ornitina se produce a partir del glutamato [351], la sfntesis de citrulina
requiere un mecanismo anapler6tico que produzca a-cetoglutarato para la sfntesis de glutamato. Esta vfa
es la asimilacidn del CO; por la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que produce oxalacetato. Este cetodcido
entrarfa en el ciclo TCA-y producirfa el cetoglutarato [225].
Por su parte, el carbamil fosfato se forma por acci6n de la carbamil fosfato sintetasa (CPS), que
cataliza una reaccidn de asimilacic^n de CO;, que requiere ATP y glutamina como donador de nitr(5geno,
que en este caso procede del grupo amida [225]:
CPS
glutamina + ATP + CO. + H.O — carbamil fosfato + glutamato + 2ADP + P,
88
Los otros dos ureidos detectados en el floema del segundo grupo de leguminosas, la alantofna y el
dcido alantoico, son compuestos estructuralmenie relacionados y se tbrman en una misma vfa bioqufmica.
Mothes [245] y Reinbothe y Mothes [289] propusieron que estos ureidos podrfan formarse por cualquiera
de las dos vfas siguientes: 1) condensacidn entre la urea y un compuesto de dos carbonos como el glioxilaio
la glicina, y 2) catabolismo oxidativo de las purinas. Aunque el ultimo de estos auiores sostenfa que la
segunda de las vfas era altamente improbable, en la actualidad se tiene la certeza de que es precisamente
«^ste el mecanismo de formacidn de alantofna y icido alantoico en el n6dulo radical, como consecuencia de
las siguientes observaciones: 1) las enzimas del catabolismo de purinas (xantina dehidrogenasa, uricasa y
alatoinasa) se encueritran en niveles muy eievados en los n6dulos de Vigna unguiculata [7,8,10], Glycine
max [1 15, 116, 3 19,348] y Phaseolus vulgaris [290,292,349,350], que son leguminosas transportadoras de
ureidos; 2) normalmente, los niveles de estas enzimas son bajos en leguminosas exponadoras de amidas.
como Lupinus luteus [290,292] y Pisum sativum [60]; 3) los niveles de estas enzimas aumeman cuando se
dispara la tljaci6n de N--, la actividad asimilatoria de amonio y la exportaci6n de ureidos en el n6dulo
[7,8. 10,292,3 19]; 4) la adici(5n de alopurinol, inhibidor irreversible de la xantina dehidrogenasa, tiene como
consecuencias una disminuci6n en los niveles de ureidos en el nddulo y en la salida de estos compuestos
al xilema, asf como un incremento en los niveles nodulares de xantina [7,8,115,354], y 5) los extractos
libres de c<Jlulas obtenidos a partir de n6dulos convierten en ureidos intermediaries como la inosina
monotosfato (IMP), la xantina monofosfato (XMP), la xantina y la hipoxantina y tambit^n en esie caso, el
alopurinol inhibe esta conversion [354,386,387].
Aunque las purinas que dan lugar a los ureidos pueden proceder de la degradaci(5n del ADN y el
ARN, en los nOdulos se sintetizan de novo en una vfa que implica la intervencidn del fosforibosilpirofosfato
(PRPP), la glutamina, el ^cido asp^rtico, CO;, glicina, metenil letrahidrotblato y tbrmil tetrahidrofolato
[9.10.290,292,321], dando como primer producto la inosina monofosfato. a partir de la cual se forman la
alantofna y el ^cido alantoico.
La inosina monofosfato es convertida en xantina monofosfato por una reacci6n catalizada por la
inosina monofosfato dehidrogenasa (IMPDH) [31,291]:
IMPDH
inosina monofosfato + NAD + H;0 xantina monofosfato + NADH -r H*
Esta enzima ha sido aislada y purificada de los nOdulos de Vigna unguiculata y tiene localizaci6n
citos6lica. si bien en los nOdulos de Glycine max se encuentra en plastos [32].
A continuacidn, la xantina monofosfato es convertida en xantosina por acci(5n de una 5' nucleotidasa
y en xantina por acci(5n de una nucleosidasa [32] y el siguiente paso es la oxidaci(5n de la xantina hasta
89
^cido urico, por accic3n de la xantina dehidrogenasa (XDH), que tambitJn puede catalizar la oxidacidn de
la hipoxantina, iniermediario en el catabolismo oxidative de las purinas [144]:
XDH
hipoxantina + NAD + H.O * xantina + NADH + H*
XDH
xantina + NAD + H.O ^cido urico + NADH + H*
Por ultimo, el ^cido urico es convertido en alantofna por la uricasa y «5sta en dcido alantoico por
la alantoinasa [144]:
uricasa
^cido lirico + O. + H.O — alantofna + H.O; + CO.
alantoinasa
alantofna + H. —* dcido alantoico.
6. El slmbiosoma como organulo Iftico. ;.Una funcion para el acido indol acelico?.
Para completar la visi6n sobre el funcionamiento del n5dulo radical conviene reparar en la
naturaleza del simbiosoma. Como es sabido, la endocitosis de bacterias Gram negativas por c^lulas
eucari6ticas suele terminar con la fusi6n el fagosoma y los lisosomas y la digestion de la bacteria. Ahora
bien, se ha propuesto que cuando el fagosoma carece de receptores para el lisosoma se produce una
endosimbiosis [53], que podrfa haber sido el punto de arranque del proceso endosimbi6tico que condujo
a la adquisici6n de las mitocondrias y los cloroplastos [53,379].
En el caso de la endosimbiosis fijadora de nitr6geno, ya se ha indicado que los bacteroides se
encuentran encerrados en org^nulos, simbiosomas, rodeados por una membrana cuya naturaleza no est^,
en absoluto clara. Para algunos autores, la membrana peribacteroidea procede de la invaginaci6n de la
membrana citoplasm^tica [18] con varias nodulinas ancladas a ella [272], pero para otros, esta
interpretaci6n es discutible. Asf, Mellor y Werner [237] consideran al simbiosoma como un organulo
temporal e independiente, recogiendo y ampliando la anterior sugerencia de Truchet y Coulomb [356] para
los que los bacteroides habitan "fitolisosomas". Despu^s de eso, se ha ido acumulando evidencia bioqufmica
que apoya la idea de que el simbiosoma es un organulo muy semejante a los lisosomas y, por consiguiente,
con una funci6n Iftica. Las principales pruebas que apoyan esta idea son las derivadas de la comparacidn
de las protefnas peribacteroideas y las de los lisosomas. En el espacio peribacteroideo de diversas
leguminosas existen a-manosidasa [235], enzima que suele ser considerada como un marcador vacuolar
90
[33], asf como proteasa ^cida (235), trealasa (189,232.241,311). De esios datos se concluye que el
simbiosoma y el lisosoma son orgdnulos similares (233).
Ahora bien, esta interpretaciOn plantea el problema de c6mo el bacteroide resiste la acci6n de las
enzimas Ifticas existentes en el simbiosoma y c6mo la entrada del endosimbionie en el simbiosoma no
termina con su digestion como ocurre en el caso de oiras bacterias Gram negativas cuando se encuentran
en el fagolisosoma. En el caso de algunas estirpes, sobre todo mutantesyic, la microscopia elecir^nica
revela que los bacteroides sutren una digesti6n muy rdpida (15,378], lo que prueba que, para el
establecimiento de una simbiosis esiable, deben existir mecanismos para proteger a los bacteroides de los
efectos del compartimento li'tico en que se encuentran. Uno de ellos puede ser la existencia de inhibidores
de proteasa, que son mol^culas que controlan la proteolisis [201]. En los vegetales los inhibidores de
proteasa se encuentran en vacuolas [373] o en determinados tipos de lisosomas como los cuerpos proieicos
[161]. En el caso de los neldulos de soja se ha encontrado una proteina de 18-20 kDa que es inhibidor de
la termolisina, una proteasa [121] y, dado que en los cotiledones se encuentra una proteina similar [121],
no debe tratarse de una nodulina.
Una caracteristica que tienen los lisosomas es su acidez y tambi^n en esto, el simbiosoma y el
lisosoma se asemejan. La acidez del primero es debida a varios factores. En primer lugar, al transporte de
^cidos dicarboxflicos [388] y, en segundo lugar, por la acci6n de una ATPasa existente en la membrana
peribacteroidea que provoca la entrada de protones hacia el simbiosoma [363]. Por otra parte, es sabido
que los rizohios son bacterias muy poco tolerantes a la acidez [131,191.248]. Por consiguiente, los
bacteroides han de poseer tambic^n mecanismos que contrarresten esta acidificaci(3n continua del simbiosoma
y que eviten que c^ste llegue a convertirse en un companimento netamente litico [183]; uno puede ser el
consumo de dicarboxilatos para la respiraci6n [35] y el otro, la excreci(3n de amonio procedente de la
actividad de la nitrogenasa [36].
Es interesante detenerse un poco a considerar la funcidn de la ATPasa existente en la membrana
peribacteroidea. Se trata de una enzima similar a la existente en la membrana citoplasm^tica de las c^lulas
del vegetal y su funci^n es la creacicln de un gradiente de protones, import^ndolos al simbiosoma con
consumo de ATP, a tin de mantener a la membrana peribacteroidea en un esiado energt^tico que permiia
el paso de solutos a travtJs de ella. Una funcidn adicional serfa mantener la electroneutralidad durante el
transporte de aniones conio el malato [363]. Si ello es asf la actividad de esta ATPasa puede resultar
imprescindible para el mantenimiento de la simbiosis eficaz. y en ello podrfa resultar util la producci(5n de
auxinas vegetales por parte del microsimbionte.
Desde hace tiempo se sabe que los rizobios producen simbic'iticamente ^cido indol ac<5tico (AIA)
y que <5ste se acumula en el ne)dulo que tiene concentraciones de la auxina superiores a las detectables en
91
el resto de los tejidos [171]. Asfmismo, se ha comprobado que la produccidn de AIA por los rizobios
responde a los mlsmos inductores que los genes nod, responsables de la nodulacidn [281]. Sin embargo,
su papel en el establecimiento y fiincionamiento de la slmbiosis es incierto. Kaneshiro y Kwolek [182]
aislaron mutantes de Bradyrhizobium hiperproductores de AIA que producen mayor niimero de n6dulos que
la estirpe silvestre y tambi^n se ha propuesto que la auxina revierte la acci(5n inhibitoria de los nitratos
sobre el crecimiento y la funcidn del nddulo [330]. Nosotros planteamos una hip6tesis alternativa, que est^
basada en la capacidad del AIA para provocar la excreci(3n de protones a trav^s de las membranas de las
c^lulas vegetales activando las ATPasas existentes en ellas [142,284,285] que ha dado origen a la
denominada teorfa del crecimiento ^cido [286]. El papel de la auxina en el funcionamiento de la simbiosis
podrfa consistir en la activaci(3n de la ATPasa de la membrana peribacteroidea para mantener el gradiente
de protones a su trav^s y la acidificaci6n del simbiosoma. En apoyo de esta idea est^ su capacidad para
revertir la inhibici6n por nitratos, ya que tSstos desacoplan la actividad de la mencionada ATPasa y el
transporte de metabolitos al simbiosoma y por, ello, inhiben la fijacidn del nitr6geno [363]. La acidez del
simbiosoma servirfa, a su vez, para mantener un gradiente de protones entre ^ste y el bacteroide
incrementando la fuerza prot6n-motriz necesaria para la sintesis del ATP que soporta la actividad de la
nitrogenasa.
Sin embargo, para tener evidencia directa del papel del AIA en 6ste y otros aspectos de la simbiosis
es imprescindible la obtenci6n de mutantes incapaces de producir la enzima, a fin de ensayar su
comportamiento simbidtico. Estos mutantes son diffciles de obtener, debido a la via de producci6n de la
auxina. En efecto, el AIA se produce como consecuencia de la oxidaci6n espont^nea del ^cido indol
piriivico producido en la desaminaci6n del triptdfano por acci6n de aminotransferasas especificas para
amino^cidos arom^ticos [269]. Por consiguiente, cualquier estrategia para obtener estos mutantes exige la
obtenci6n de estirpes carentes de estas transaminasas y ello se ve dificultado por el hecho de que,
generalmente, los rizobios contienen m^s de una de tales enzimas [194,269,270]. Nosotros disponemos de
una estirpe de Bradyrhizobium (Chamaecytisus) que s61o tiene una de estas transaminasas [138] y que, por
ello, resulta muy apropiado para la obtenci6n de los mencionados mutantes AIA'.
7. i.Por que solo las leguminosas?
Como ya se ha indicado, los rizobios s6lo infectan a las leguminosas y cada estirpe bacteriana
concreta lo hace a una gama tambi^n concreta de leguminosas hospedadoras, existiendo estirpes de gama
amplia de hospedadores (pueden intectar a muchas plantas diferentes), o de gama estrecha (por el contrario,
infectan un conjunto reducido de leguminosas) [389]. Durante mucho tiempo se ha especulado sobre las
92
bases moleculares de esta especificidad y pronto se supuso que era consecuencia de un intercambio de
senaJes entre ambos miembros de la asociaci(5n simbi(5tica. Sin embargo, hasta que no ha sido posible la
manipulaci(5n gen^tica de los dos, no se ha podido tener una vision m^ o menos clara de la secuencia de
eventos iniciales que conducen a la int"ecci(3n (215) y actualmenie se sabe que en este intercambio de senaJes
se encuentra la base de la especificidad, que esti controlado por genes, tanto de la bacteria como de la
leguminosa hospedadora. Esta libera una serie de compuestos que actiian como senales para inducir la
expresi(3n coordinada de los genes bacterianos necesarios para la nodulaci(3n. Estos genes, de los que se
han identitlcado mis de cuarenta [338], reciben el nombre de genes nod y, como su numero es mayor que
el de letras del alfabeto. reciben tambitJn el nombre de genes nol [310]. Estos genes codifican las enzimas
necesarias para la sfntesis de los denominados factores Nod, que son oligosaclridos sustitufdos que
provocan cambios morfol6gicos en la rai'z de la planta y actiian tambi^n como determinantes de la gama
de hospedadores de un estirpe concreta de rizobio.
En todas las especies de Rhizobium estudiadas hasta ahora. los genes nod se encuentran localizados
en los pllsmidos simbidticos, mientras que en Bradyrhizobium y Azorhizobium, son de localizaci6n
cromosdmica y en los tres casos, se encuentran agrupados en diferentes operones y se regulan de forma
coordinada por el regul(5n nod [262]. El anllisis gen^tico ha permitido dividirlos en tres grupos: genes nod
comunes, genes nod especificos del hospedador {hsn), y genes nod especiTicos del cultivar o del genoiipo
(CSN o GSN) [355].
7.1. Genes /lo^ comunes
Los genes comunes de la nodulaci6n son un conjunto de genes nod que se encuentran estructural
y funcionaimenie muy conservados en la mayor parte de los rizobios estudiados, como se deduce de los
estudios de secuenciaci(3n de ADN [94,305.353], de mutagiJnesis con el trasposdn Tn5 [80], anllisis de
complementaci6n [69,110,163.175] y el anllisis de los productos gt^nicos [84,94,318]. Estos estudios han
permitido identitlcar en Rhizobium. que es el g^nero mejor estudiado en este sentido, tres conjuntos de estos
genes comunes: los genes nodABC, que son esenciales para la curvatura del pelo radical y el comienzo de
las divisiones celulares. los genes nodlJ. que estln situados direcci6n abajo del gen nodC, y el gen
regulador nodD, que precede a los anteriores y se transcribe en direccic3n opuesta a (Jstos [47]. Las
mutaciones de los genes nodABC bloquean por completo la nodulacidn y todas producen un fenotipo
similar: las bacterias mutadas en cualquiera de estos genes casi no promueven curvatura del pelo radical
(fenotipo Hac ) ni divisiones celulares [214]. Por su parte, las mutaciones en nodD dan el mismo fenotipo,
pero ello se explica por la funcidn reguladora que, como se verl. ejerce nodD sobre nodABC. Este papel
93
regulador del gen nodD se ve apoyado por el hecho de que a partir de su secuencia de nucleotides se puede
deducir que su producto en R. leguminosarum tiene homologfa con el dominio de uni6n a! ADN de la
protefna reguladora araC do, E. coli [327]. Como han sugerido Wijffelman y col. [380], es probable que
se trate de un "filtro molecular" que reconoce concentraciones de compuestos reguladores (activadores e
inhibidores) liberados por una leguminosa concreta. El gen nodC codifica una protefna hidr6foba que, segun
se desprende de datos inmunoldgicos y bioqufmicos, debe ser una protefna integral de la membrana
implicada en el reconocimiento de seiiales en la misma [178]. La protefna NodA tambi^n debe localizarse
en la membrana y se produce en pequerias cantidades en las c^lulas de R. meliloti [95].
Las mutaciones. en los genes nodlJ s61o producen defectos marginales en el fenotipo de la
nodulacidn, que en R. trifolii pueden traducirse en un ligero retraso en la aparici6n del n6dulo [262], una
curvatura exagerada del pelo radical (fenotipo Hac++) [80] y en ocasiones a la formacidn de tubos de
infecci(3n cortos y abortivos [80]. En R. meliloti las mutaciones en nodlJ provocan una proporci6n
anormalmente alta de pelos radicales curvados e infectados, que no afectan al niimero de n6dulos; es m^s,
se ha comprobado que estas mutaciones retrasan la nodulaci(5n [262]. El andlisis de la secuencia de ADN
demuestra que la protefna del gen nodi guarda una homologfa significativa con una familia de protefnas que
ligan ATP e intervienen en diversos procesos de la biologfa de muchas bacterias [153], la mayor parte de
las cuales se encuentran localizadas en la membrana citoplasm^tica de Salmonella typhimurium y
Escherichia coli y normalmente intervienen en el transporte activo de compuestos de bajo peso molecular
como histidina, maltosa, oligoptJptidos, fosfato y ribosa [153]. Por su parte, el producto del gen nodJ es
una protefna hidrdfoba y forma parte integral de la membrana [99].
7.2. Genes nod especificos del hospedador
Los genes nod que controlan la especitlcidad por el hospedador (antes denominados genes hsn) son
los que controlan la especificidad de una bacteria por una leguminosa concreta. Estos genes se han
identificado siguiendo dos criterios: por un lado, se trata de los genes que hay que introducir en una especie
concreta de rizobio para hacerla infectiva en leguminosas que, normalmente, son infectadas s61o por el
rizobio donador y, por otro, son genes cuyas mutaciones alteran la gama de hospedadores de un rizobio
y no pueden ser complementadas introduciendo los genes correspondientes (y, en ocasiones, con un alto
grado de homologfa) procedentes de otra especie [78]. Con estos criterios se han caracterizado con detalle
los genes nodFEGH de R. meliloti y nodFE de R. leguminosarum y R. trifolii. Asf, por ejemplo, en R.
trifolii las mutaciones en los genes nodFE tienen como consecuencia una aiteracidn de la gama de
hospedadores: mientras que la estirpe silvestre infecta r^pidamente diversas razas de tr(ibol, los mutantes
94
nodFE nodulan muy d<^bilmente al tr^bol bianco y al rojo [80] y. en contraste con la estirpe parental.
infectan guisanies; aunque provocan la t'ormacic'tn de tubos de infecci6n en el tr^bol subierr^neo. la
int"ecci6n no culmina con la tormaci(3n de n6dulos. Estos resultados indican que los genes nodFE conirolan
la especificidad por el hospedador y son dominanies sobre oiros genes nod especiTicos de hospedador.
Demuestran, asimismo, que las plantas de tr^bol bianco impiden la nodulaci6n por los mutantes, y las de
guisante impiden la infeccidn por las estirpes silvestres (pero no por las mutantes) de R. trifolii.
7.3. Productos de los genes nod
Los genes nod, tanto comunes como especftlcos de hospedador, controlan la producci6n de un
factor (denominado factor Nod) de naturaleza giicolipfdica que provoca la deformaci6n del pelo radical y
las divisiones celulares de la leguminosa compatible. El primero que se identities fue el denominado factor
NodRm-l [211], que es un factor Nod producido por R. meliloti. Se trata de un tetrasac^rido de residuos
de D-glucosamina unidas por enlace 13 (1—^), que est^ sulfatado y tiene acetilados tres de los grupos
amino. El extremo no reducior de la moltJcula contiene un ^cido graso no saturado de 16 ^tomos de
carbono, y el extremo reductor, un grupo sulfato. Posteriormente, se ban aislado otros diversos factores
Nod producidos por R. meliloti y otras especies de Rhizobium y Bradyrhizobium y se ha propuesio una
nomenclatura uniforme para ellos [301]. Por ejemplo, el factor NodRm-l ahora se denomina NodRm-IV(S).
Rm signitlca R. meliloti. IV indica los cuatro residuos de glucosamina y S. el grupo sulfato local izado en
el extremo reductor de la mol^cula. Los factores Nod de R.leguminosarum bv viciae pueden ser tetra o
penta glucosaminas. est^n acetilados y carecen de grupos sulfato; se designan como Rlv-IV(Ac) o Rlv-
V(Ac). En R. meliloti se han detectado varios factores Nod; todos lienen una estructura b^sica similar a
la de NodRm-l. pero algunos carecen de grupo sulfato [211], otros est^n formados por cinco residuos de
glucosamina [322] y otros por s6\o tres de estos residuos [322]. Al menos existen cinco factores Nod
producidos por R. leguminosarum y la diferencia mis evidente con respecto a los producidos por R. meliloti
es la carencia de grupos sulfato; los de R. leguminosarum bv. viciae ditleren de NodRm-l, ademis, en la
longiiud de la cadena carbonada existente en el extremo no reductor de la moli^cula: en este caso se trata
de una cadena de 18 Itomos de carbono y contiene cuatro dobles enlaces [335]; ademls, en el extremo no
reductor existe un grupo O-acetilo [335]. Las estirpes de Bradyrhizobium tambi<§n segregan factores Nod
formados blsicamente por glucosamina, pero que ditleren de los de Rhizobium en la naturaleza de los
sustituyentes; por ejemplo, en el extremo reductor hay un residuo de 5-o-metil-fucosa [156].
95
CH20H CHgOH HoCOSOoH
HO
HO
NH
I CO
I CH
//
HC
(CH2)5
CH
II
CH
(CH2)5
CH«
NH
I
CO
CH,
OH
Figura 5. Estructura general de un factor Nod.n representa el niimero de residues de glucosamina. El
lipido local izado en el extremo de la mol^cula es tipico de los factores Nod segregados por R. meliloti. Las
flechas indican los papeles propuestos para cada gen twd.
La sintesis de estos factores Nod est^ controlada por los genes nod. En la figura 5 se expone la
estructura general de los factores Nod conocidos hasta ahora y el presunto papel de los diversos genes nod
en su sintesis. Por ejemplo, nodC que, al parecer, tiene una secuencia similar a la del gen de la quitfn
sintasa de levaduras [156], controlarfa la uni6n por enlace B(l-^4) entre los residuos de glucosamina,
sintetizados bajo el control de nodM, cuya secuencia es homdloga con la del gen glmS de E. coli, que
codif'ica la D-glucosamina sintetasa [12]. El producto de nodL acetilarfa los residuos de glucosamina [83]
y los genes nodEF controlarfan la sintesis de ^cido graso [162,327].
Cuando se tratan las raices de alfalfa con una preparaci(3n puriflcada de cualquier factor NodRm
provoca la deformacitin de los pelos radicales a la concentraci6n 10""M, mientras que a una concentraci6n
10"^M estimula la division de las ctJlulas corticales [358]. Sin embargo, las rafces de leguminosas que no
son hospedadoras de R. meliloti como la arveja {Vicia sativa), no responden a la adici(3n de NodRm- 1 a
esas concentraciones, aunque sus pelos radicales se deforman cuando son tratadas con factores Nod de R.
meliloti que carecen de grupo sulfato, como NodRm-2 [211], con factores Nod de pentaglucosamina a
la concentracic'in de 10* lO'^M [322], lo que, a nuestro juicio, demuestra que los factores Nod tienen la
capacidad de disparar de manera especiTica los primeros estadios del proceso de nodulaci(3n y que esta
especitlcidad depende de la estructura y composici6n quimica de cada factor.
96
7.4. Regulacion de los genes nod
El linico gen nod que se expresa de manera constitutiva es nodD, que se encuentra en todos los
rizobios investigados hasta ahora. En muchos casos existe una sola copia de esie gen, pero en otros
constituyen una familia multig^nica [3,64.159]. Dado que los genes nodD de las diferenies especies de
Rhizobium se diferencian en su respuesta a los exudados de los diversos hospedadores y se manifiestan de
una manera especffica de especie [162,158] es probable que la presencia de diversos alelos nodD en una
misma bacteria permita a <Jsta responder a los diversos inductores producidos por sus diversos
hospedadores, haciendo de esta forma Optima su respuesta simbi(3tica [150,140,159]. Los dem^ genes nod
s(51o se expresan en presencia de la leguminosa compatible o de sus exudados radicales, lo que indica que
la planta produce mol^culas que actiian como seiiales para la inducci6n de estos genes.
La mayor parte de los operones nod inducibles est^n precedidos por unas secuencias consenso de
47 pares de bases, altamente conservadas, que se denominan cajas nod [306] o cajas de nodulaci6n y son
secuencias reguladoras en cis que coordinan la expresi(3n de los operones nod. La proteina NodD se une,
incluso en ausencia del inductor producido por la planta, a dos regiones de estas cajas nod [109] por medio
del extremo amino terminal de la mol^cula, que est^ mucho m^ conservada que la mitad carboxilo terminal
[162,307], lo que implica que esta mitad desempena funciones diversas, como, por ejemplo, el
reconocimiento de inductores diferentes [43,44,162], mientras que la mitad amino terminal sirve para la
unidn al ADN [327]. Sin embargo, este resultado est^ sometido a coniroversia porque algunos trabajos con
mutantes dobles [44] y con genes nodD quim(^ricos [336] sugieren que la parte carboxilo terminal tambitJn
se une al ADN y que NodD no consta de dos dominios separados. La protefna se encuentra localizada en
la membrana y ello sugiere que su extremo carboxilo terminal mira hacia la parte externa de la c«51ula a fm
de reconocer los inductores, mientras que el extremo amino tienen una localizacidn hacia el citoplasma y
se encuentra unido a la caja nod.
En R. meUloti se ha encontrado una protefna represora que actiia en nans, uni^ndose a los
promotores de nodD y disminuyendo de esta forma la cantidad de la proteina NoD disponible. De esta
forma, en R. meUloti la transcripci6n de los operones nod inducibles se encuentra sometida, tanto a control
positive, ejercido por inductores secretados por la leguminosa hospedadora, y negativo, ejercido por la
proteina represora. En otras especies de Rhizobium o Bradyrhizobium no se han encontrado protefnas de
este tipo.
Con los datos que acabamos de describir, se han elaborado diversos modelos de regulacion de la
expresidn de los operones nod: la protefna NodD se une a la caja nod incluso en ausencia del inductor (esta
uni(3n he sido demostrada in vitro pero aiin no ha sido confirmada in vivo) y, despu«is de unirse al inductor
97
producido por la leguminosa hospedadora, experimenta un cambio conformacional [79,196] que le permite
activar la transcripci6n. En el caso de R. meliloti esta activaci6n debe impedir la uni6n de la proteina
represora y promover el comienzo de la transcripci(3n coordinada del reguldn nod por medio de la ARN
polimerasa [196,306]. Sin embargo, queda pendiente la respuesta a varias preguntas como, por ejemplo,
mediante qutS mecanismos se unen los inductores a NodD y curies son las modificaciones estructurales que
ello provoca, c6mo es la uni6n de NodD a la ARN polimerasa de la bacteria, o la posible funci(3n de NodD
en estadios posteriores del desarroUo del n6dulo.
7.5. Moleculas inductoras producidas por la planta hospedadora
Como queda dicho, los genes nod inducibles s61o se expresan en presencia de exudados radicales
de la leguminosa compatible [70,215,389]. La ultima d^cada ha estado dedicada, en parte, a la
identificaci6n de los componentes de los exudados que ejercen esta acci(3n inductora, para lo que ha sido
de gran utilidad la utilizaci(3n de estirpes bacterianas que Uevan la fiisi6n nod-lacZ [79,130,272,287]. Estos
trabajos recibieron un fuerte impulso cuando se demostrd que algunos compuestos fen61icos sencillos
liberados por tejidos vegetales heridos inducen la expresi6n de los genes vir de Agrobacterium spp. [339];
por otra parte, desde antiguo es conocido que las raices de los vegetales exudan flavonoides [217], pero
este hecho habia pasado inadvertido porque no se concebia el modo en los microorganismos del suelo
pudieran utilizar metabolitos producidos por otros seres vivos en cantidades traza [277]. Estos trabajos han
conducido al descubrimiento de ciertos compuestos de los exudados radicales como inductores de los genes
nod. En las simbiosis de climas templados, como alfalfa/^, meliloti, guisante/7?. leguminosarum y tr6bo\/R.
trifolii, los inductores son flavonas, flavonoles y flavanonas sustituidas [108,271,287], asi como chalconas
[276], y en la simbiosis entre soja y Bradyrhizobium , isoflavonas sustituidas [197].
Isoflavonas Flavonas Flavanonas
98
EI hecho de que estos compuestos puedan ser aislados a partir de las semillas, plintulas en cullivo
ax^nico o rafces indica que no es necesaria una senal bacieriana para la induccicin de la producci(3n de
tlavonas o isotlavonas. De hecho, estos compuestos se sintetizan como productos de la vfa central de los
fenilpropanoides existente en las plantas [146], son liberados al medio independieniemente de su capacidad
inductora de los genes nod de la esiirpe de rizobio especffica, y su naturaleza y la cantidad en que son
producidos depende de la planta [141,271,275,302,390] y de su estado de desarrollo [148]. En los casos
de la alfalfa, la judfa o la soja, la gama de flavonoides exudados por las rafces es diferente de la de los que
son producidos por las semillas [132.149,150,169,170,271]. Los flavonoides son liberados por la plama
en forma de agliconas o de derivados glicosilados de baja actividad pero muy solubles [150,223] que son
convertidos en la forma activa por acci(3n de glicosidasas bacierianas [71]. Las sustancias inductoras son
muy potentes y ejercen su acci(3n a concentraciones del orden nanomolar y se consigue una inducci6n total
a concentraciones comprendidas entre 10"* y 5xlO*'M [391]. Con tines comparatives, se puede citar que
los inductores de los operones del metabolismo de la laciosa y de la arabinosa actiian a concentraciones
superiores en tres a cinco drdenes de magnitud [262].
Los diversos flavonoides producidos por la planta ejercen diferentes acciones sobre los genes nod.
Asf, en aigunos casos, flavonoides que carecen de actividad inductora son inhibidores de la activaci(5n por
pane de inductores eflcaces [79,108,141,198,272]. Por regla general, los anti-inductores tienen la misma
estructura que los inductores y la inhibici(3n puede compensarse mediante la adici(3n de concentraciones
crecientes de (^stos [272], por lo que pueden ser considerados con inhibidores competitivos [71], aigunos
de los cuales son tambit^n especiTicos y s61o actiian sobre estirpes bacterianas que son activadas por
inductores producidos por leguminosas pertenecientes al mismo grupo de inoculacii3n cruzada [198]. Por
contra, tambit^n se ha detectado un efecto sin<^rgico entre flavonoides producidos por la misma planta
1148.149.150] pero ello puede ser explicado teniendo en cuenta que en algunas especies existen varios
alelos del gen nodD, de forma que un conjunto de varios de estos genes interactuando con diferentes
inductores, tendrfa mayor actividad que uno solo [71].
Hasta hace relativamente poco tiempo, s61o se habfa podido detectar la capacidad de las pUntulas
(o las semillas) de las leguminosas para producir los flavonoides inductores o antiinductores bajo
condiciones controladas del laboratorio, pero no se habfa detectado su presencia real en los ecosistemas
naturales donde se supone que deben actuar. Recientemente. uno de nosotros [206] ha podido aislar de la
rizosfera de alfalfa la formononetina-7-0-gluc6sido. que activa las protei'nas NodDl y NodD2 de R.
mcliloii.
Los tlavonoides tambit^n pueden intluir en los rizobios del suelo por mecanismos diferentes de la
activacic'in de los operones nod. Asi, aunque Rhizobium y Bradyrhizohium son atraidos por compuestos
99
ten<31icos que son nutrientes potenciales para estas bacterias [264,273], esta atraccidn tambitJn la ejercen,
a muy baja concentraci6n, compuestos como los flavonoides que pueden no tener valor como nutrientes
[1,5,46,185]. En el caso de R. meliloti, la capacidad quimiot^ctica de los tlavonoides est^ estrechamente
relacionada con su capacidad inductora y requiere la existencia de los genes nodD y nodABC actiwos [46];
por su parte, en R. leguminosarum y R. phaseoU esta correlacidn es menos evidente y la quimiotaxis es
independiente de los genes nod [1,5]. Un hecho interesante es que el crecimiento de R. meliloti en medios
minimos se estimula tiiertemente (el tiempo de duplicaci6n se reduce a la quinta parte) cuando se afiaden
al medio a concentraciones micromolares luteolina u otros flavonoides producidos por el hospedador, con
independencia de que sean o no inductores de los operones nod [148]. El mecanismo de esta estimulacidn
del crecimiento es desconocido, pero, junto con la respuesta quimiot^ctica puede contribuir a mantener una
poblacic'in elevada de la bacteria especiTica en la rizostera de la leguminosa.
8. Aplicaciones agrfcolas
Siendo las leguminosas uno de los grupos vegetales que contiene un mayor niimero de especies de
intertis para la nutrici6n humana y animal, no es de extranar que, coincidiendo con el creciente interns
cientftlco por la fijaci6n simbi6tica del nitr6geno, se haya centrado la atenci6n en los aspectos aplicados
de la simbiosis entre estas plantas y las bacterias de los g^neros Rhizobium y Bradyrhizobium . Ya hemos
indicado cdmo el empleo de leguminosas, junto con el de los cereales, en agricultura se remonta a los
tiempos m^s antiguos y c6mo desde hace mucho tiempo se tiene conciencia del efecto beneficioso de la
rotaci6n de cultivos para el rendimiento de las cosechas. Por ello, esta pr^ctica se ha extendido y en la
actualidad puede ser considerada como habitual en la agricultura de la mayor parte de los paises. Se tienen
la tendencia a considerar a las leguminosas exclusivamente como fuente de alimentos. Si bien es verdad
que son aprovechadas como forrajeras, y para la obtenci(3n de aceites y de granos para la alimentaci6n
humana y animal, no debe olvidarse que tambi^n son utiles para otros tines. Asf, pueden ser utilizadas para
la fertilizaci6n de pastizales, como abono verde, como plantas madereras y en silvicultura. El denominado
abono verde es la forma de utilizaci6n que, en teoria, produce m^s benetlcios para el terreno. Consiste en
enterrar el cultivo de leguminosa al tlnal de su cicio de crecimiento y se trata de una t(^cnica de abonado
muy frecuente en los paises tropicales y subtropicales, en los que la posibilidad de cultivar plantas en
cualquier ^poca del ano facilita la introducci6n de abonos verdes en el intervalo que media entre los cultivos
m^s importantes, como el arroz, la cana de azucar y otros [324]. Las leguminosas arb(5reas, como, por
ejemplo, las del gt^nero Acacia, son utilizadas para la obtenci6n de madera y, en silvicultura, tambi^n se
ha demostrado la conveniencia de introducir leguminosas en las plantaciones de otros ^rboles. Por ejemplo,
100
Haynes y col . , [151] describen un experimento muy inieresante que consisii(3 en introducir diversas especies
de los gt^neros Trifolium y Vicia en plantaciones de Plaianus occidenialis de tres anos de edad. Cinco anos
desputJs, la altura. el di^metro y el fndice volum^irico de los ^rboles eran significativamente mayores que.
los de plantaciones control en las que no se habfan introducido leguminosas. En el caso de los Irboles
cultivados conjuntamente con Trifolium subterraneum, el fndice volum^trico quintuplicaba al de los ^rboles
control. En Nueva Zelanda se ha introducido Lupinus arboreus en plantaciones de pino Monterey que se
localizan en terrenos arenosos y muy improductivos; con ello se ha logrado disminuir la dependencia de
estas plantaciones de abonos anificiales [1 19].
Ahora bien, aunque en condiciones naturales, las leguminosas pueden estar bien noduladas por
estirpes de rizobios existentes en los suelos, las pr^cticas agrfcolas tales como la introducci6n de
monocultivos o la aplicacic^n incontrolada de fertilizantes, de herbicidas y de pesticidas, pueden alterar la
composicit'Jn de la biota del suelo y provocar una p<Jrdida de infectividad de los mismos. Por ello, salvo
que se conozca la existencia previa de la esiirpe de rizobio adecuada para la leguminosa que se desea
cultivar, suele ser necesario introducir en el suelo la estirpe bacteriana especiTica, no s6\o la primera vez,
sino en ocasiones durante varios afios, a tin de lograr que se estabilice una poblaci6n adecuada de la misma.
Esta introducci(3n puede hacerse inoculando directamente el suelo, o bien, inoculando las semillas antes
de la siembra. generalmente, resulta mis t'icW y es mis etlcaz inocular las semillas, lo que suele hacerse
banlndolas en una suspension del inOculo (aproximadamente, 4 g por kg de semillas) en algun Ifquido
adhesivo, como, por ejemplo, goma ardbiga. Una vez secas, se puede proceder a la siembra. En muchos
casos esta tt^cnica es util no s61o porque asegura una inoculacidn uniforme de cada semilla, sino porque al
humedecerla, tavorece la germinaci6n. Sin embargo, en otros casos puede no ser de tanta utilidad: en
ocasiones las semillas deben ser tratadas con fungicidas que resultan t6xicos para la bacteria; en otras veces,
la semilla puede ser demasiado frlgil (como la del cacahuete) para soportar el tratamiento o de tamano
demasiado pequeno (como en muchas especies de Trifolium) para conseguir en cada una de ellas un niimero
de bacterias sutlciente para asegurar una nodulaci(3n etlcaz, y a veces. como en los casos de la soja y el
altramuz. la envoltura de la semilla se separa de ^sta en una etapa muy temprana de la germinaci6n
reduciendo la probabilidad de contacto de la bacteria con la nueva raiz. En estos casos puede ser mis litil
introducir el inoculante directamente en el suelo, inoculando una zona hiimeda interna, que estl por debajo
de la supertlcie seca sobre la que se dispone la semilla. Cuando ^sta germina. la rafz entra en contacto con
la zona densamente poblada por los rizobios introducidos en las capas inferiores del suelo.
Es evidente que debe hacerse una cuidadosa seleccidn de la estirpe de rizobio que se utiliza como
inoculante. Es claro que esta estirpe debe ser capaz de intectar a la leguminosa en cuestieJn, pero, como
regla general, debe hacerlo bajo una amplia gama de condiciones ambientales (acidez, salinidad, carencia
101
de agua, presencia de pesticidas, etcetera). Pero, adem^s, debe ser capaz de competir con otras estirpes de
Rhizobium o Bradyrhizohium que pudieran existir en el suelo y limitar la nodulaci6n por la estirpe utilizada
como inoculante. Tambi«Jn son importantes factores bioldgicos del suelo, como la presencia de otros
microorganismos, especialmente las micorrizas, ya que se ha demostrado que la simbiosis triple leguminosa-rizobio-
micorriza aumenta la nodulaci6n y la tasa de fijacidn de nitr6geno, sobre todo en suelos pobres en
f(3sforo [14].
En general, se recomienda aumentar el cultivo de leguminosas con el fin de disponer de un
adecuado suministro de alimentos proteicos. En efecto, aunque no hay una consenso general sobre la
cantidad de proteina adecuada en la dieta humana, se estime que debe rondar los 70 gramos diarios, pero,
lamentablemente, una parte importante de la poblacidn est^ muy por debajo de este consumo diario e,
incluso, por debajo de los 36 g diarios que recomendaron en 1 .973 la FAO y la OMS como mfnimo
absolute para una persona de 65 kg de peso [119]. Admitiendo que la poblacidn mundial actual est^ en
torno a 5.200 millones (datos de 1.990), la produccidn global de proteina debe ser de 1,3 x 10* toneladas
al ano. Esta cantidad se supera cada ano [268], lo que sugiere que, en teoria, se produce suficiente protefna
para alimentar a la poblaci6n mundial. El problema, por un lado, radica en el reparto desigual de esta
producci6n. Asf, mientras en los paises industrializados de Europa Occidental y Norteamt^rica hay una
superproduccidn de alimentos proteicos, en los paises subdesarroUados un elevado porcentaje de la
poblaci6n pasa hambre. Otro problema es que el mero dato de consumo de proteina por habitante no es
sutlciente, ya que no tiene en cuenta la composici6n en amino^cidos de las diferentes protemas. Asf, por
ejemplo, la protefna de trigo es det~iciente en lisina, mientras que la de las leguminosas lo es en metionina.
Por consiguiente, las necesidades nutricionales del hombre se satisfacen mejor con una dieta proteica
compuesta por una mezcla de cereales y leguminosas que por cualquiera de los dos tipos de vegetales.
Teniendo en cuenta ^stas y otras consideraciones. Hardy [147] ha propuesto duplicar hasta 2,6 x 10^
toneladas al afio la producci6n de cereales y cuadruplicar hasta 50 x 10* toneladas la de leguminosas. Sin
embargo, el incremento del cultivo de leguminosas y su introducci6n en nuevos pafses tropieza con algunos
obst^culos. Algunos de ellos son de naturaleza cultural. Muchas sociedades no tienen el h^bito de cultivar
y de consumir leguminosas y se resisten a adoptarlas como alimento b^sico. La idea, muy extendida en la
sociedad occidental, de que las leguminosas son un alimento reservado a los menos pudientes ha
determinado en gran medida la preferencia por la carne o el pescado como suplemento proteico a la dieta
b^sica de cereales. El otro problema es de fndole pr^ctica y econ(3mica y deriva del hecho de que un
aumento en la tasa de tljaci(3n de nitr6geno en un suelo lleva aparejado un incremento en el consumo de
otros elementos como potasio, f6sforo, calcio y azufre que hay que aportar si no se encuentran en cantidad
sutlciente para un rendimiento (3ptimo de las cosechas. Tambit^n pueden convertirse en factores limitantes
102
el molibdeno, como parte consiitutiva de la nitrogenasa, y el cobalto, constituyente de la leghemoglobina.
En deierminados suelos deficientes en estos elememos habri de coniemplarse la necesidad de su adici(3n.
La clave para un uso mis eficaz de las leguminosas es la tbrmaci6n del agriculior, que incluye una
explicaci(5n racional de las ventajas de la rotacitfn de cultivos, la inconveniencia de un aporte excesivo de
abonos nitrogenados, la necesidad de lograr una infecci6n eficaz, lo que implica introducir bacterias (la
estirpe de Rhizobium o de Bradyrhizobium adecuada) en el suelo, bien directamente. bien inoculando las
semillas y, por supuesto, sobre una adecuada comercializaci(3n de sus cosechas [119]. Ahora bien, debe
tenerse en cuenta que las finalidades del aumento de producci6n de las cosechas son diferentes segun el Irea
geogr^tlca que se considere. En los paises avanzados. en los que el problema es de superproducci6n de
alimenios, la expioiacidn de la fijaci6n de niir(3geno servirfa, si acaso. para disminuir los cosios de las
cosechas. Sin embargo, en los pafses en vfas de desarrollo o sub-desarrollados la situaci^n econ6mica es
muy diferente: existe en ellos un claro deficit en alimentos proteicos y la utilizaci6n de abonos nitrogenados
etlcaces es diffcil porque en muchos de ellos no existe una industria qui'mica local y la importaciiSn de
abonos es tan dificil y tan cara como la de alimentos. En esta situaci(3n, la explotaci(3n de plantas fijadoras
de nitr6geno puede ser una necesidad imperiosa, pero teniendo en cuenta. como senala Halliday [143], que
el uso de las leguminosas debe llegar a ser un- complemento a la utilizaciOn de abonos nitrogenados para
el cultivo de cereales, pero nunca llegar a sustituirla por compleio.
9. Consideraciones finales y perspectivas
La simbiosis entre los rizobios y las leguminosas se ha convertido en el paradigma de las
interacciones entre los microorganismos y las plantas, debido sobre todo al enorme esl\jerzo investigador
que ha concitado, desde las investigaciones agronOimicas hasta la biologfa molecular y se trata de un ^rea
de en la que coinciden como en pocas los aspectos de investigaci6n llamada b^sica y aplicada.
Una de las cuestiones m^s interesantes que pueden ser abordadas es la relativa al significado de la
simbiosis. Suele considerarse como evidente que la simbiosis entre los rizobios y las leguminosas es una
relaci(5n mutualista en la que ambos elementos obtienen beneficio. En el caso de la leguminosa hospedadora
el benetlcio es claro: tiene un aporte directo de nitr6geno que le permite vivir en suelos detlciente en
tbrmas combinadas de este elemento. Sin embargo, en el caso del elemento bacteriano de la asociaci(5n el
benetlcio es notablemente m^s dudoso. En efecto, como queda dicho. los rizobios se diferencian a
bacteroides para lograr una simbiosis eficaz y «Jsta es una forma bacteriana que puede ser considerada "a
ttJrmino". Realmente, est^ sometido a controversia si la diferenciaci6n a bacteroide es o no reversible
[2,359], pero parece confirmarse que S(31aes posible en medios especificos [345.359] y. por ello. resulta
103
improbable que sea signitlcativa en los ambientes naturales y es m^s probable que sean destruidos durante
la senescencia del n6dulo [261], cuando el simbiosoma adquiere su car^cter Iftico. Por consiguiente, se
plantea la aparente paradoja de que en el curso de la evoluci6n se haya mantenido un genotipo (el que
determina la capacidad para infectar a las leguminosas) que resulta letal para la bacteria, ya que los
bacteroides no contribuyen a las gene