Dimorfismo y virulencia de hongos patógenos para humanos

              Rev. Acad. Canar .Cienc . , V (Num. 4), 9-23 (1993)
DIMORFISMO Y V/IRULENCIA DE HONGOS PATOGENOS PARA HUMANGS: ALGUNOS
ASPECTOS BIOaUIMICOS(»)
Gioconda San-Blas
Instituto Venezolano de I n vest i gac i ones Cienti-ficas (IVIC), Centre de
Mi crobi ol og i a y Biologia Celular, Apartado 21827, Car aca^ 1020A,
VENEZUELA
ABSTRACT
Some biochemical mechanisms (sulphydryl groups, hormonal
receptors, proteinases) involved in the processes o-f virulence and
dimorphism in -fungi pathogenic -for humans are reviewed.
KEY WORDS: Pathogenic -fungi, dimorphism, pathogenicity.
RESUMEN
Se revisan diversos mecanismos bioquimicos (grupos sul -f i dr i 1 os ,
receptores hormonales, proteinasas) involucrados en el control de la
virulencia y el dimor-fismo de hongos pat6genos para humanos.
PALABRAS CLAVES: Hongos pat6genos, dimor-fismo, patogen i c i dad
1. INTRODUCCION
Muchos hongos zoopat og ^n i cos crecen en m,^s de una mor-fologia,
con una -fase sapro-fitica usalmente consistente en hi-fas, y una -fase
parasitaria, -f r ecuen t emen t e expresada como levadura. Esta dualidad
fenotipica se ha 1 1 amado dimor-fismo C14I1. El dimor-fismo es un modelo
util para examinar las bases de la mor -f og^nesi s y la d i -f er enc i ac i 6n
celular en eucariotes y su explicacidn podria ser util para entender
1 OS mecanismos de control de un grupo importante de micosis que
(OEste trabajo es un resumen del material presentado cooio Conferencia Inaugural
|del Primer Conqreso Nacional de Micologia, realizado en Tenerife, en julio de 1992.
a-fligen al hombre y a 1 05 animales. La temper at ur a , o -factores
nutr i c i onal es, o ambos, son general mente 1 05 agentes que accionan 1 os
mecanismos conducentes al cambio en la mor-fologia -fungica.
Si bien 1 05 estudios bioquimicos de regulaci6n de la
patogeni c i dad y del d i mor -F i smo todavia no se conocen en pr o-f undi dad ,
la literatura actual sobre el tema indica que hay algunos ejemplos
ilustrativDS sobre estos -fenbmenos.
2. GRUPOS SULFIDRILOS
2.1. Histoplasma capsulatum
H. capsul atum es un hongo pat6geno dim6r-fico causante de la
histoplasmosis. En su estadio sapr o-f i t i co , el hongo est(i bajo la
forma -filamentosa o micelial (M) pero en el hu^sped existe como
levadura (L) gemante. En el laboratorio, la -fase M puede convertirse
a la L cambiando la temperatura de incubaci6n de 25°C a 37°C. Sin
embargo, para que este cambio se manifieste, es indispensable que el
medio de cultivo contenga grupos sul -f i dr i 1 os . Garrison y col. [63
demostraron que la cisteina y la cistina eran t r anspor t adas en -forma
activa en la levadura por una permeasa dependiente de ATP y que el 1 as
estimulaban la respiracidn fungica al incorporarse al ciclo de Krebs
como Acido piruvico. Tambi^n demostraron que 1 os efectos en la
respiracidn eran una buena medida de la i ncor por ac i 6n de estos
compuestos. Maresca y col. [113 retomaron estos estudios y compro-baron
que las levaduras incubadas a 37°C tenian un nivel m^s alto de
respiraci6n que 1 os micelios incubados a 25°C (6,6 y 2,8 nmol Q^ por
10
min por mg peso seco, respec 1 1 vamen te ) . Al 1 1 evar la levad'ara a 25°C.
la respiracibn caia a niveles car ac t er i st i cos del micelio y
viceversa. La adici6n de cisteina o cistina al medio estimulci la
respiracidn de la levadura pero no la de micelio. El estudio de la
respiracicin en la t r ans-f or mac i 6n M- L revel 6 la existencia de tres
estadios ClOD durante las primeras 24 a 48 horas del aumento de
temperatura se produce una disminuci6n progresiva en la rata de
respiraci6n y en la concen tr ac i 6n intracelular de cisteina; como
segundo estadio ocurre una suspensi6n total de la respiraci6n a la
vez que el nivel de cisteina cae a su m^s bajo valor. Para pasar al
estadio tercero, despu^s de 4 a 6 dias, se requiere de la adici6n
ex6gena de cisteina que provoca la activaci6n de la respiracidn
mitocondrial y conduce a la culminaci6n d^ la transicicin mor -f ol 6g i c a
.
En ese momento, la rata de respiraci6n se restaura y se aumentan 1 os
niveles de cisteina a 1 os valores iniciales.
Debido a que 1 os cambios de morfoiogia est^n relacionados con la
virulencia, cualquier bloqueo gen^tico o -fisiolbgico en la trans-for-maci6n
M-- L tiene especial interns como posible arma terap^utica. A
tal e-fecto, Medo-f-f y col. [123 estudiaron el e-fecto del .^cido p-c
1 oromercur i -f em 1 sul -f 6n 1 CO (PCMS), un agente bloqueador de grupos -
SH, en la tr ans-f or mac i 6n M -» L con el -fin de veri-ficar la hip6tesis de
que el estado redox de algunos grupos -SH podia controlar el
dimor-fismo. Cuando 1 os micelios -fueron expuestos a PCMS 100 pM por 24
horas, crecieron normalmente a 25°C aunque al ser tr ans-f er i dos a 37°C
no -fueron capaces de transformar, e-fecto que result6 irreversible aun
11
despu^s de multiples pasajes en medio sin PCMS. Aunque se desconoce
la raz6n de este e-fecto, se ha sugerido que el PCNS podria curar la
c^lula de algun plAsmido o inhibir alguna t r ansl ocac i 6n cromos6mica,
quiziis similar al efecto observado en 1 os tipos sexuales en levaduras
[73. Este micelio bloqueado en su tr ans-f ormac i 6n a levadura es
su-ficiente para provocar una respuesta inmune protectora en animales
y por lo tanto tiene un interns terap^utico potencial. De hecho,
Medof-f y col.C12D demostraron que a pesar de no existir di-ferencias
en la virulencia de levadura normales o tratadas con PCMS en ratones
CD-I, 1 OS micelios de H. capsul atum tratados con PCMS no -fueron
capaces de transformar a levaduras en esos mi smos ratones. M-^s aun,
al aumentar la concentr ac i 6n de micelios tratados con PCMS se
aument6 en -forma si gni -f i cat i va la sobr evi venc i a de ratones 1 uego de
la in-fecci6n con cepas virulentas de levaduras, siendo esta
supervi venc i a proporcional a la dosis de indculo inmunizador. Este
en-foque experimental est<^ resultando de interns en la posible
preparaci6n de vacunas ex per i men t al es contra la histoplasmosis.
2.2. Paracoccidioides brasiliensis
En el modelo de dimor-fismo de P. br asi 1 i ensi s presentado por
Kanetsuna y col. C8D y comp 1 emen t ado por San-Blas y San-Blas C14], se
en-fatiza el papel de 1 os grupos sul-fidrilos de las proteinas de pared
celular en el dimor-fismo de este hongo. Al igual que en H. capsul a-tum
, P. br asi 1 i ensi s p'^esenta dimor-fismo t^rmico, pr oduc i ^ndose una
fase M a 23°C y una L a 37°C, e-fecto que es reversible y dependiente
unicamente de la temperature C 8 II . Resultados ex per i men t al es C8]
12
indican que la fase L tiene una actividad de 5 a 8 veces mayor de la
enzima proteina disul-furo reductasa (PDR) que la -fase M, actividad
que provoca el rompimiento de 1 os grupos disulfuros en las proteinas
de la pared celular y que genera proteinas de cadena m^s corta en la
levadura que en el micelio, propiciando de esta manera el establecx-miento
de una -forma redondeada en la -fase L con mayor actividad de
PDR y de proteinas largas en el micelio, en armonia con la con-figura-ci6n
de las hi-fas. Esta hipdtesis permite suponer que cualquier
e-fecto que perturbe la actividad de PDR en P. br asi 1 i ensi s conducirA
a modi -f i cac 1 ones en el proceso de tr ans-f or maci 6n M-» L.
Con este en-foque experimental se han comenzado estudios para
precisar el e-fecto de derivados de ajo ( Alii urn sat i vum ) sobre
P. br asi 1 i ensi s . Se ha reportado que 1 os extractos acuosos de ajo
tiene un e-fecto anti-fungico sobre Candida albican s habi^ndose
propuesto verios sitios de acci6n, par t i cul armen t e como i nac t i vador es
de tioles esenciales C2,3,53. El ajoene es un derivado quimico de la
alicina del ajo y ha sido introducido hace algunos anos como
inhibidor de la agregaci6n plaquetaria CID. Su acci6n como posible
agente anti-fungico -fue reportado por primera vez en Aspergillus niqer
y C. al bi cans por Yoshida y col. [93 quienes sugirieron que el ajoene
bloqueaba algun paso de sintesis de la pared celular, Trabajos
ulteriores C19D indicaron que el crecimiento de P . br asi 1 i ensi s &r
^
inhibido por el ajoene, siendo la -fase L m<is sensible que la M a la
acci6n de este agente. Si bien el mecanismo de acci6n no fue
elucidado, 1 os datos provenientes de microscopia electr6nica
13
sugirieron que la i n t er f erenc i a primaria estaba a nivel de la
membrana c i top 1 asm,it i ca , con un e-fecto secundario eventual sobre la
pared celular. M.i5 aun, el e-fecto inhibitorio del ajoene sobre la
fase L (no asi sobre la fase M) es revertido con la adici6n de
compuestos protectores de grupos sul-fidrilos tales como cisteina o
mercaptoetanol . Adem^s, el proceso de t r ans-f or mac i 6n M-* L (pero no el
reverso) es bloqueado en presencia de ajoene C16]. Como quiera que la
estructura quimica del ajoene contiene un puente disul-furo, es
probable que compuestos protectores de 1 os grupos sul-fidrilos sean
capaces de revertir la accidn del ajoene precisamente a trav^s de
esos puentes disul-furos, quiz<^5 porque el ajoene estaria -funcionando
como un competidor de las proteinas contentivas de disul-furos,
haciendo que la enzima PDR actue en el ajoene y no hacia su bianco
natural, De esta manera, las proteinas no pueden acor-tarse a las
cadenas m<is pequenas car act er i st i cas de la -fase L, con lo que se
fuerza al honqo a mantenerse bajo la -fase M.
S. RECEPTQRES HORMONALES
Los receptores de hormonas esteroideas han tenido interns para
1 OS estudiosos de la par acocc i d i oi domi cosi s debido a que si bien el
contacto con P . brasi 1 i ensi s es igualmente -frecuente en hombres y
mujeres, la en-fermedad es de 13 a 87 veces mcks -frecuente en hombres
C13I1 lo cual sugiere alqun e-fecto hormonal en la diseminaci6n de la
in-fecci6n. Estudios realizados al e-fecto [13D indican que el citosol
de P. brasi 1 i ensi s es capa^ de enlazar 17 i^-estradiol en -forma
14
especi-fica, e-fecto que no se observb con t est ost er ona , 17 a-estradiol
o cor t i cost er ona , y s61o parcialmente (25'/.) con estrona, estriol y
pr ogest er ona . La anulaci6n del efecto con la adicidn de tripsina y
N-et i 1 mal ei mi da sugirib la naturaleza proteica del receptor y la
necesidad de qrupos disul-furos como elementos activos del proceso de
recepci6n C9]. MAs aun, el estradiol -fue capaz de inhibir la trans-formacibn
M— L en P_. b r asi 1 i ensi s , paso indispensable en el proceso
de in-fecci6n. De alli que Ids autores sugieran que 1 os estrigenos
end6genos del hu^sped actuen a trav^s de la proteina receptora del
hongo, inhibiendo la t r ans-f or mac i 6n M-- L, lo cual explicaria la
resistencia de las mujeres a la par acocc i d i oi domi cos i s C13].
El e-fecto del estradiol en la mor -f og^nesi s de P. brasiliensis
pudo ser observado en la expresi6n de proteinas C4]. El an^Iisis
el ec tr o-f or ^t i CO de proteinas citos61icas por SDS-PAGE revel6 la
existencia de 12 bandas asociadas al micelio (entre 1 os rangos de 30
a 140 kDa) y 18 bandas asociadas a la -fase 1 ev adur i -P or me (entre 22 y
127 kDa). En c^lulas que t r ans-f or maban del micelio a levadura se
observ6 una progresi6n hacia el per-fil de proteinas de levaduras a la
vez que se produjeron 5 bandas nuevas (23 a 50 kDa) , bandas que eran
transitorias durante el proceso de tr ans-f or mac i 6n . El tratamiento de
micelios con estradiol alter6 1 os per-files observados en condiciones
normales: 4 de 12 bandas asociadas al micelio se mantuvieron mientras
que la aparici6n de las 5 bandas de transici6n y 9 de las 18 bandas
asociadas a la levadura -fueron bloqueadas o demoradas. Estos -^esulta-dos
apoyan la hipbtesis de que en analogia a la acci6n de receptores
15
hormonales en mami -f er os , la respuesta -funcional de P. br asi 1 i ensi s a
estradiol est^ relacionada con la regulaci6n de la expresi6n de
proteinas, mediada a trav^s de un complejo proteina receptora ligando
que repercute directamente en la expresibn de la virulencia del
hongo.
4. PROTEINASAS
4.1. Coccidioides immitis
El ciclo parasitario de C. i mmi t i s , es iniciado por la trans-for-maci6n
de la artroconidia in-fecciosa presente en el aire en una
es-f^rula mul t i nuc 1 eada que se aloja en el tracto respiratorio y
alcanza 1 os alv^olos. El contenido de las es-f^rulas es convertido
eventual mente en una multitud de pequenas endosporas uninucleadas que
al diseminarse provocan la en-f er medad C20]. Esta tr ans-f or mac i 6n es de
primordial importancia en la patogenia de la en-Fermedad, raz^n por la
cual se han comenzado estudio que permitan elucidar 1 os mecanismos
bioquimicos que la regulan. Yuan y Cole [20,21] estudiaron
macromol ^cul as solubles en agua provenientes de paredes celulares de
conidias (SCWF), demostrando que entre ellas existia una proteinasa
capaz de digerir elastina y coli^geno, importantes proteinas
estr uc t ural es de 1 os pulmones, asi como tambi^n sIgA, i nmunog 1 obul i na
que provee anticuerpos a las super-ficies de mucosas. La electro-
-foresis en SDS-PAGE indic6 que esta proteinasa correspondia a una
mol^cula de peso molecular 36.000 kDa, tenia un pH 6ptimo de 8,0 y
una temperatura 6ptima de 35° a 40°C. Los substratos pre-feridos -fueron
16
colAgeno, elastina, hemoglobina, IgG, sIgA y caseina. Como inhi-bidores
actuaban d i soprop i 1 f os-f o-f 1 uor i dat o , TPCK, a-1 an 1 1 t r i psi na,
PMSF y qui most at i na , todo lo cual la caracteriza como una serina
proteinasa del tipo qui motr i psi na . La enzima se encontraba m^s
concentrada en la pared del aparato de segmentaci6n de las es-f^rulas
momentos antes de comenzar el proceso de d i -f erenc i ac i dn de endosporas
[22]. Asi mismo, la presencia de un inhibidor de la proteinasa -fue
detectada del citosol y de la pared celular del hongo C21]. Con todos
estos datos, 1 os autores sugieren que la proteinasa podria ser una
enzima alost^rica bajo el control del modulador inhibitorio que
dejaria de ejercer su e-fecto en el momento en que la es-f^rula debe
pasar a la -fase -final indispensable del proceso invasivo como es la
producci6n de las endosporas.
4.2. Paracoccidioides brasiliensis
En el modelo de dimor-fismo de P . br asi 1 i ensi s presentado por
Kanetsuna y col. C8] y 1 uego comp 1 emen t ado por San-Blas y San-Blas
C14D, el principal elemento de consi der ac i (in en el control de la
regulaci6n de la t r ans-f or mac i 6n radica en la presencia de a- 1,3-
gluci^n en^ la -fase L del hongo y su sustituci6n por (I -1,3-glucin en
la -fase M. Estudios in vitro sobre la sintesis de i^ -gluc^n en
P. br asi 1 i ensi s C15] indican que la UDP-glucosa actua como nuclebtido
pre-f erenc i al con la par t i c i pac i 6n de la enzima glucAn sintetasa que
se encuentra particulada en las membranas y que es m<^s activa a 23°C
que a 37°C. Cur i osament e , tanto la enzima proveniente de levadura
como de micelio provocan la sintesis de (I -gluc^n y en ningun caso de
17
a -gluc^n. Consi derando que la levadura 56I0 contiene trazas de
(I -gluc^n, se ha postul ado la hipdlesis de que proteinasas presentes
en el citoplasma podrian regular el control de la sirTtesis del poli-
5ac<^rido a -fin de que ^ste se produzca mayormente durante el creci-miento
micelial y se restrinja durante la •fDrmaci6n de levaduras
C18]. Resultados in^ditos (San-Blas y col abor adores ) sugieren que
este es en realidad el caso. Se ha encontrado que existe una pro-teinasa
neutra i n t r acel ul ar , con car ac t er i st i cas de serina proteinasa
que permanece activa durante el crecimiento de micelio y en la trans-formacibn
L-* M . Al contrario, la actividad decrece durante el creci-miento
1 evadur i -forme y en la t r ans-f or mac i 6n M-^ L . Estos datos apoyan
la hip6tesis planteada por San-Blas y col. CIQ] en cuanto a la parti-cipacidn
de proteinasa en el control de la sintesis de (I -gluc^n y
por ende, en la regulaci6n del dimor-fismo de P. brasi 1 i ensi s , siendo
este proceso indispensable para el est abl ec i mi ento de la in-fecci6n.
5. CONCLUSIONES
Los ejemplos arriba senalados permiten establecer la existencia
de controles biqquimicos de la patogen i c i dad y el dimor-fismo en
ciertos bongos. Sin embargo, con el 1 os s61o estamos comenzando un
estudio que tiene mucho que o-frecer en cuanto a las posi b i 1 i dades de
conocer reguladores bioldgicos para el tratamiento de algunas micosis
que a-fligen a la humanidad. Al mismo tiempo, estos estudios revelan
la existencia todavia no comprobada de otros eventos que van desde la
activaci6n de genes hasta el cambio mor-f ol 6gi co, algunos de 1 os
18
cuales ser i an 1 os verdaderos causantes de las regulaciones bioquimi-cas
aqui senaladas, Es de esperarse, por \o tanto, que las investiqa-ciones
continuen en estas 1 i neas a fin de entender con propiedad
estos -fencbmenos y aplicarlos en el control de las en-f er medades
mi ccit i cas.
AGRADECIMIENTOS: Al Comity Organizador del I Congreso Nacional de
Micologia por su invitaci6n a dictar la Con-ferencia Inaugural de ese
evento, y a la Academia Canaria de Ciencias por -financiar 1 os gastos
de traslado a Teneri-fe.
19
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