Evidencias moleculares confirman la presencia de Valonia aegagropila en Canarias

              Rev. Acad. Canar. Ciena, Vol. XXV, 59-66 (diciembre de 2013)
EVIDENCIAS MOLECULARES CONFIRMAN LA PRESENCIA
DE VALONIA AEGA GROPILA EN CANARIAS
M. Machin-Sanchez 1
, J. Diaz-Larrea2
, A. Perez-Ruzafa3
,
J. J. Bacallado4 & Ma C. Gil-Rodriguez 1
1 Area de Botanica. Universidad de La Laguna. Tenerife. http://www.mcgilrodriguez.es/
2 Departamento de Hidrobiologia. Universidad Autonoma Metropolitana-Iztapalapa. Mexico
3 Departamento de Ecologia e Hidrologia. Universidad de Murcia
4 Museo de Ciencias Naturales de Tenerife
RESUMEN
Estudios morfologicos previos establecen para Canarias tres especies de algas ver-des
del genero Valonia (V. aegagropila, V macrophysa y V. utricularis). La caracterizacion
de V. aegagropila aunque, por su inconfundible habito gregario-esferico ("ball-like" "algal-balls
o "egagropilas") es diferenciable de V. utricularis, la superposition de caracteres mor-fologicos
hace tediosa su asignacion especifica, basicamente en sus talos jovenes epiliticos.
Basandose en analisis filogeneticos del gen 18S, los autores ratifican la presencia de V. ae-gagropila
en las islas Canarias.
Palabras clave: Algas verdes, Valonia aegagropila, bentopleustofitos, islas Canarias,
"ball-like", egagropilas, 18S.
ABSTRACT
Previous morphological articles recorded three green species of Valonia genus for the
Canary islands {V. aegagropila, V. macrophysa y V. utricularis). Taking into account the mor-phological
characters the species Valonia aegagropila distinguished from V. utricularis by
the ball-like habit, although the specific morphological delimitation could be some tedious be-cause
of the overlapping morhological characters basically in young ephillitic thallus. Based
on molecular phylogenetics analysis of 18S gene the authors confirm the presence of V. ae-gagropila
in Canary Islands.
Key words: Green algae, Valonia aegagropila, benthopleustophytes, egagropilas, Ca-nary
Islands, ball-like, aegagropilous, 18S.
1. INTRODUCCION
El Charco de San Gines se encuentra situado en la costa norte de Arrecife (Lanzarote,
islas Canarias) (fig. 1) donde la plataforma rocosa esta llena de arrecifes, bajas e islotes; so-
59
metido a los movimientos de mareas se ha convertido en uno de los atractivos naturales mas
atrayentes de la capital de la isla [5]. En el Charco los condicionantes de la aparicion de la in-teresante
y diversa flora marina que alberga [4] [3] son los microambientes creados al refu-gio
del arrecife y determinados por la tranquilidad de sus aguas, la alta luminosidad, el tipo
de sustrato, la presencia de nutrientes, la mayor temperatura y la proteccion que ofrece.
Segun Gil-Rodriguez et al. [2] el genero Valonia C. Agardh esta representado en las
islas Canarias por tres especies, V. aegagropila C. Agardh, V. macrophysa Kiitzing y V. utri-cularis
(Roth) C. Agardh.
V. aegagropila cuyos talos cenociticos alcanzan desde 4 a mas de 12 cm de diametro,
en estado adulto (Lamina 1 A), estan formados por celulas grandes y turgentes. Su inconfun-dible
habito globoso y libre ("ball-like" "algal-balls" o "egagropilas") es claramente diferen-ciable
de los talos jovenes del taxon (Lamina IB), nunca libres y siempre epiliticos, pudiendo
ser estos confundidos con talos de V. utricularis [3 ] [10] (Lamina 1C).
En determinadas epocas los talos adultos de V. aegagropila suponen un componente
algal muy importante de las comunidades vegetales del Charco, donde sus acumulos llegan a
ser espectaculares. Las bolas "egagropilas", en ocasiones uniespecificas, pueden encontrarse
asociadas a otras especies de algas verdes (Chaetomorpha Kiitzing, Cladophora Kiitzing, Er-nodesmis
Boergesen) y algas rojas (Amphiroa Lamouroux y Jania Lamouroux) entre otras.
Este bentopleustofito -planta acuatica yacente sobre el fondo sin medios de sujecion y facil-mente
trasladables- se diferencia claramente de la tercera especie del genero presente en Ca-narias,
V. macrophysa. Taxon este caracterizado por talos constituidos por una sola celula o
bien por agregados de pocas celulas (vesiculas) de gran tamano y redondeadas; asimismo su
presencia en habitats sombrios y profundos del sublitoral es otra particularidad que nos per-mite
segregarla de V. aegagropila [3] [10].
60
Lamina 1.- A: V. aegagropila, talo adulto; B: V. aegagropila, talo joven epilitico; C: V. uthcula-ris.
(Fotos: J. Alemany)
61
En los ultimos anos y coincidicndo con epocas primaverales se ha detectado, en la re-ferida
laguna, una ingcntc acumulacion dc bolas dc considerable tamano. Gil-Rodriguez el al.
[3] basandose en los caracteres morfologicos y a falta de los resultados del estudio genetico
que sugieren en sus conclusiones, determinan las muestras recolcctadas en el Charco como I
aegagropila. En esta publicacion se aportan los datos moleculares que validan la mencionada
determinacion.
Estando este trabajo en prensa se nos comunica la presencia de ejemplares de "ega-gropilas"
de Valonia , localizadas en una localidad situada en las cercanias dc Montana Ber-meja
y el Golfo, oeste de la isla de Lanzarote (Hernandez-Toledo, com. pers.).
2. MATERIAL Y METODOS
Aunque desde el ano 2004 al 2007 fueron vistos acumulos de V. aegagropila, fue du-rante
los meses de febrero a julio de 2012, cuando se realizo la exploracion en todo el Charco
de San Gines, Arrecife (Lanzarote) (fig. 1 ). En abril se recolecto el material utilizado para los
analisis moleculares en tres puntos del referido Charco, distantes entre ellos mas de 10 me-tros
y referenciados como MMS0116 (28°57'39,, ;13°32 ,
38), MMS0117 (28°57'78 ,,
;
13°32'50") y MMS00118 ( 28 57 ,42,,
;13 32 ,48,,
) (Lamina 2A). Asimismo recolectamos en
tres puntos del litoral de Punta del Hidalgo, Tenerife (fig. 1), muestras de V. utricularis (PI:
Faro, 28° 34' 34";16°19'69"; P2: Roca Negra 28° 34' 26";16 19'55" y P3: Las Furnias, 28° 34'
^"j^^O'Ol") (Lamina 2B) que fueron utilizadas para los analisis moleculares comparativos.
Ejemplares de los especimenes examinados fueron incluidos en el Herbario TFC (Tenerife
Ciencias, Universidad de La Laguna).
Analisis molecular
Las muestras procesadas en el analisis molecular, tras ser liberadas de epifitos, se pre-servaron
en silicagel. El ADN total fue extraido con el Mini Kit DNeasy Plant (Qiagen, Va-lencia-
California, EUA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Un total de 1.703 pares
de bases del gen 18S fueron amplificados con el Taq PCR Core Kit (Qiagen), utilizando los
"primers" recomendados por Saunders et al. [11]. El tamano de los productos de la amplifi-cacion
se reviso con un gel de agarosa al 1%. Los productos de PCR se purificaron con el Kit
Qiagen QIAquick, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
La secuenciacion se realizo con el Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Reaction
(Applied Biosystems, New Jersey-USA) en un secuenciador ABI PRIS M3 100 Genetic Analy-zer
(Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA). Los "primers" utilizados en el proceso de
secuenciacion y amplificacion fueron similares.
Alineamiento de secuenciasy analisis filogeneticos
Las secuencias obtenidas fueron alineadas y editadas con el programa Sequence Na-vigator
(Applied Biosystems, Branchburg, NJ, EUA). Se utilizo el algoritmo de CLUSTAL
[13] para alinear las secuencias.
Las relaciones filogeneticas se infirieron con los programas Winclada ver. 1 .00.08 [9]
y TOPALi v2 [7]. El analisis de Maxima Parsimonia se realizo con la busqueda de Ratchet [8]
y los valores de soporte de las topologias obtenidas se estimaron mediante el analisis de bo-otstrap
[1] con 1.000 replicas.
62
El modelo de sustirucion nucleotidico utilizado en el analisis Bayesiano fue el gene-ral
de reversion a lo largo del tiempo (GTR), proporcion de sitio sin variables (I) y distribu-cion
gamma (G) para los sitios variables. Este modelo fue seleccionado con la prueba de la
razon de Maxima Verosimilitud (ML) implementado en el programa TOPALi v2 con un nivel
de significancia de 0,01. Para el analisis Bayesiano se corrieron cinco cadenas con el metodo
63
de Markov Chain Monte Carlo (una calicnte y cuatro frias), dondc sc muestreo un arbol cada
1 .000 gcncracioncs, para un total de 5.000.000 dc gcncracioncs.
Los valores de porcentaje de divergencia entre las secuencias del gen 18S a nivel in-terespecifico
e intraespecifico, se calcularon mediante la distancia no corregida "p" imple-mentada
en el programa PAUP*4.0blO [12].
3. RESULTADOS Y DISCUSION
Se analizaron 18 secuencias incluyendo los grupos externos Boergesenia fbrbesii (Har-vey)
Feldmann, Siphonocladus tropicus (Crouan & Crouan) J. Agardh y Ernodermis vertici-llata
(Kiitzing) Boergesen. Las hipotesis filogeneticas obtenidas con los metodos de Maxima
Parsimonia y analisis Bayesiano fueron similares. La topologia Bayesiana (fig. 2) corrobora
la presencia de V. aegagropila en Lanzarote, ya que las muestras denominadas como V. cf. ae-
Hoergesenia forhessi (HQ 1 73706)
Diclyosphaena cavernosa Japan (AM498755)
^ r— Valonia fastigiata Seychelles (AM498763)
Ventncana venlncosa Virgin Islands (AM502590)
" Valonia aegagropila Japan (AM498762)
92 <>s
40 44
" V. cf aegagropila Lan/arotc. Canary Islands. Spain (KF279398)
L-| V. cf aegagropila Lan/.arotc : Canary Islands. Spain (KF279400)
V. cf aegagropila Lan/arotc, Canary Islands. Spain (KF279399)
100 100
Valonia utricularis (Z35323)
V. utricularis Tcncrifc, Canary Islands, Spain (KF279397)
V. utricularis Tcncnfc. Canary Islands. Spain (KF279396)
V. utricularis Tcncnfc, Canary islands. Spain (KF279395)
Valomopsis pachynema Australia (AM498764)
Microdictyon boergesenii Cape Verde (AM498759)
Ulva curvala (AF 189078)
Ulothrix zonata USA (AY278217)
— Krnodesmis verticillata Spain (AM498758)
— Siphonocladus tropicus Spain (AM498761
)
changes
Figura 2.- Topologia Bayesiana basada en secuencias del gen 18S para especies de Valonia. Los numeros
de los nodos indican valores de bootstrap > 50% para Maxima Parsimonia (izquierda) y de probabili-dad
posterior Bayesiana (derecha).
64
gagropila, recolectadas en el Charco San Gines, se ubican en el mismo elado que la muestra
de V. aegagropila del Genbank (AM498762). Las secuencias de las tres muestras recolecta-das
difieren en un intervalo de 0-0,6%, y a su vez difieren de la muestra del Genbank en 1%,
lo que corrobora que pertenecen a la misma entidad taxonomica: V. aegagropila. Los valo-res
de porcentajes de divergencia obtenidos son comparables con los estimados por Leliaert
etal. [6].
Asimismo esta topologia confirma la presencia de V. utricularis en Tenerife a la vez que
establece las diferencias entre ambos taxones, ya que las muestras recolectadas en Punta del
Hidalgo, Tenerife se ubican en el mismo elado que la muestra de V. utricularis del Genbank
(Z35323) (fig. 2). Las secuencias de las tres muestras recolectadas difieren en un intervalo de
0,2-0,3%, y a su vez difieren de la muestra del Genbank en 1%, lo que corrobora que perte-necen
a la misma entidad taxonomica: V. utricularis. Los valores de porcentaje de divergen-cia
obtenidos son comparables con los estimados por Leliaert et al. [6].
4. AGRADECIMIENTOS
Los autores quieren agradecer la colaboracion y apoyo logistico de la Concejalia de
Medio Ambiente del Excmo. Ayuntamiento de Arrecife, en especial a Dna. Rut Hernandez To-ledo,
Tecnico de Medio Ambiente del mencionado Ayuntamiento. A D. Andres Delgado por
la inestimable ayuda en la mejora de la calidad fotografica y en la elaboracion de las laminas.
5. BIBLIOGRAFI
A
[1] FELSENSTEIN, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bo-otstrap.
Evolution 39: 783-91.
[2] GIL-RODRIGUEZ, M.C., R. HAROUN, A., OJEDA RODRIGUEZ, E. BERECIBAR
ZUGASTI, P. DOMINGUEZ SANTANA & B. HERRERA MORAN. 2003. Proctoc-tista.
In: Lista de especies marinas de Canarias (algas, hongos, piantas y animales).
(Moro, L., Martin, J.L. Garrido, M.J. & Izquierdo, I. Eds), pp. 5-30. Las Palmas: Con-sejeria
de Politica Territorial y Medio Ambiente del Gobierno de Canarias.
[3] GIL-RODRIGUEZ, M.C., M. MACHIN-SANCHEZ, M. CARRILLO, J.J. BACA-LLADO,
A. PEREZ-RUZAFA, L. MORO, J. NUNEZ FRAGA & J.M. ALEMANY.
2012. Sobre la biota del charco de San Gines y la presencia de "egagropilas" de Valonia
en Lanzarote, Islas Canarias. Rev. Acad. Canr. Cienc.,Wo\ XXIV: 9-28.
[4] GUADALUPE GONZALEZ, M.E., M.C. GIL-RODRIGUEZ & M.C. HERNANDEZ-GONZALEZ.
1996. Flora y vegetacion marina de Arrecife de Lanzarote. Islas Canarias.
Fundacion Cesar Manrique, Lanzarote. Ed. Torcusa. Madrid. 269 pp.
[5] http://www.lanzarote.org/es/charco_san_gines_lanzarote.html. 12 junio 2012.
[6] LELIAERT, F., O. DE CLERCK, H. VERBRUGGEN, CH. BOEDEKER, E. COPPE-JANS.
2007. Molecular Phylogenetics and Evolution (44): 1237-1256.
[7] MILNE, L., D. LINDNER, M. BAYER, D. HUSMEIER, G. MCGUIRE, D.F. MARS-HALL
& F. WRIGHT. 2009. TOPALi v2: a rich graphical interface for evolutionary
analyses of multiple alignments on HPC clusters and multi-core desktops. Bioinforma-tics
applications note 25 (1): 126-127.
65
[8] NIXON, K.C. 1999. The parsimony ratchet, a new method for rapid parsimony analysis.
Cladistics 15: 407-414.
[9] NIXON, K.C. 1999-2002. WinClada ver. 1.0000 Published by the author, Ithaca, NY,
USA.
[10] RODRfGUEZ-PRIETO, C, E. BALLESTEROS, F. BOISSET & J. AFONSO-CARRI-LLO.
2013. Guia de las Macroalgas y Fanerogamas marinas del Mediterrdneo occi-dental.
Ed. Omega 656 pp.
[11] SAUNDERS, G.W., I.M. STRACHAN, J. A. WEST & G.T. KRAFT. 1996. Nuclear
small-subunit ribosomal RNA gene sequences from representatives Ceramiaceae (Cera-miales,
Rhodophyta). European Journal ofPhycology 31 : 23-29.
DOI: 1 0. 1 080/0967026960065 1151.
[12] SWOFFORD, D. L. 2002. PAUP. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other
Methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.
[ 1 3] THOMPSON, J.D., D.G. HIGGINS & T.J. GIBSON. 1 994. CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, po-sitions-
specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673-
4680.
66